ERK1/2 es una señal organizadora ancestral en hendidura en espiral

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 2286 (2022) Citar este artículo

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El desarrollo animal se clasifica como condicional o autónomo en función de si los destinos celulares se especifican a través de señales inductivas o determinantes maternos, respectivamente. Sin embargo, sigue sin estar claro cómo evolucionaron estos dos principales modos de desarrollo. Durante la escisión en espiral, una embriogénesis estereotipada ancestral de 15 grupos de invertebrados, incluidos moluscos y anélidos, la mayoría de los linajes especifican los destinos celulares de forma condicional, mientras que algunos definen los destinos axiales primarios de forma autónoma. Para identificar los mecanismos que impulsan este cambio, estudiamos Owenia fusiformis, un anélido condicional de ramificación temprana. En Owenia, la señalización del receptor de FGF mediada por ERK1/2 especifica el progenitor endomesodérmico. Esta célula probablemente actúa como organizadora, induciendo destinos mesodérmicos y posterodorsales en las células vecinas y reprimiendo las señales de anteriorización. El papel organizador de ERK1/2 en Owenia se comparte con los moluscos, pero no con los anélidos autónomos. Juntos, estos hallazgos sugieren que la especificación condicional de un organizador embrionario ERK1/2+ es ancestral en la división en espiral y se perdió repetidamente en linajes de anélidos con desarrollo autónomo.

El compromiso de las primeras células embrionarias con destinos de desarrollo más restringidos (p. ej., endodermo, neuroectodermo y mesodermo) es un paso fundamental en la embriogénesis animal que conduce al establecimiento de planes corporales e influye en el desarrollo posterior1,2,3. Para definir esta organización espacial temprana, los embriones animales combinan interacciones célula-célula condicionales e inductivas con la herencia asimétrica de determinantes maternos autónomos de células1,2,4. Con frecuencia, una de estas estrategias de desarrollo es predominante y, por lo tanto, la embriogénesis animal se define como condicional o autónoma1,2,4. Durante la evolución, los linajes de animales han hecho la transición entre estos dos modos principales de especificación del destino celular5. Sin embargo, no está claro cómo ocurren estas transiciones de desarrollo porque a menudo coinciden con una variación adicional en la embriogénesis temprana (p. ej., en los patrones de escisión6,7) que hace que las causas de los cambios en la especificación del destino celular sean difíciles de identificar.

La escisión en espiral es un programa de desarrollo temprano antiguo y estereotípico caracterizado por divisiones celulares oblicuas alternas desde la etapa de 4 células en adelante que se encuentra entre los grupos de invertebrados dentro de Spiralia, incluidos los moluscos y los anélidos8,9 (Fig. 1a). Los embriones que se escinden en espiral organizan los destinos celulares en torno a cuatro cuadrantes embrionarios, denominados A–D, que corresponden aproximadamente a los lados izquierdo, ventral, derecho y dorsal del cuerpo, respectivamente8,9. Aunque la escisión en espiral a menudo se representa como un ejemplo de libro de texto de desarrollo autónomo2,4, los embriones en escisión en espiral especifican sus identidades axiales de manera condicional o autónoma, sin que esto afecte la conservación general del programa de escisión y los linajes de células embrionarias8,9,10 (Fig. 1b). En el modo condicional de especificación del destino celular, las señales inductivas entre las células del polo animal y un blastómero vegetal en la etapa de ~32–64 células comprometen a este último con el destino dorsal D11. Esta célula actuará como organizador embrionario, instruyendo a las células vecinas hacia ciertos destinos y estableciendo el plan corporal del animal (Fig. 1b). Este modo de división en espiral está muy extendido y es muy probable que sea un antepasado de Spiralia11,12,13 (pero véase Dohle para una hipótesis alternativa14) (Fig. 1c). Sin embargo, algunos linajes de moluscos y anélidos11,12 especifican las identidades axiales a través de la segregación asimétrica de determinantes maternos a un blastómero en el embrión en etapa de 4 células15,16,17 (Fig. 1b). Este blastómero adoptará el destino dorsal D, y uno de sus descendientes actuará posteriormente como organizador embrionario. Por lo tanto, la presencia de modos de desarrollo tanto condicionales como autónomos en animales de hendidura en espiral12 es un sistema ideal para identificar los mecanismos celulares y moleculares que sustentan las transiciones de especificación del destino celular en embriones animales. Sin embargo, los mecanismos que regulan la división en espiral y, por extensión, los cambios en el modo de desarrollo, son poco conocidos.

a La división en espiral es un modo de desarrollo estereotípico ancestral de Spiralia (p. ej., caracoles y gusanos segmentados), uno de los tres linajes principales de animales con simetría bilateral (Bilateria). La escisión en espiral se caracteriza por divisiones celulares oblicuas alternas (flechas rojas) a lo largo del eje vegetal animal desde la etapa de 4 células en adelante. b Los embriones que se escinden en espiral especifican sus identidades axiales y su organizador embrionario de forma condicional o autónoma. En el modo condicional, la especificación de la identidad posterodorsal (cuadrante D; representado como D) y el organizador embrionario ocurre tarde en la escisión (~32–64 etapas celulares, dependiendo de la especie) a través de señales inductivas. Sin embargo, el modo autónomo de especificación del destino celular se basa en factores maternos segregados diferencialmente (puntos rojos) que especifican el cuadrante D ya en la etapa de 4 células (célula con D). Posteriormente, durante la escisión, una célula del cuadrante D que presumiblemente hereda parte de esos factores maternos actuará como organizador embrionario. c El modo condicional se encuentra en todos los linajes espiralianos que exhiben división en espiral y el modo autónomo solo se observa en Mollusca y Annelida, lo que sugiere que la especificación condicional es ancestral. Si bien los moluscos condicionales y autónomos utilizan la MAP quinasa ERK1/2 para establecer su plan corporal, todos los anélidos autónomos estudiados no se basan en esta cascada de señalización y el conocimiento fuera de Mollusca y Annelida está ausente. Los mecanismos ancestrales que controlan la escisión en espiral aún se desconocen, lo que limita nuestra comprensión de la evolución de Spiralia. El anélido condicional Owenia fusiformis, como miembro del linaje hermano de todos los anélidos restantes, puede ayudar a inferir caracteres de desarrollo ancestrales para Annelida y Spiralia en su conjunto. Los dibujos no están en escala.

La vía de señalización ERK1 / 2, una cascada intracelular de quinasas 18 conservada evolutivamente, especifica la identidad del cuadrante D dorsal y controla la actividad de organización en Mollusca (Fig. 1c; Tabla complementaria 1). En muchos moluscos condicionales, las interacciones inductivas activan ERK1/2 en el blastómero que adopta el destino D dorsal y actúa como organizador embrionario19,20,21,22,23, aunque la identidad del linaje de esa célula varía según la especie (Tabla complementaria 1). Del mismo modo, se requiere ERK1/2 difosforilado activo en el blastómero del cuadrante D que funciona como organizador embrionario24 en el molusco autónomo Tritia obsoleta17. Sin embargo, en Annelida, las especies autónomas exhiben diversos patrones de actividad de ERK1/2 y no requieren esta vía de señalización para especificar el cuadrante D dorsal y el organizador embrionario25,26,27,28 (Fig. 1c; Tabla complementaria 1). Sin embargo, se desconoce el papel de ERK1 / 2 durante la escisión en espiral para los anélidos condicionales, así como para la mayoría de los otros grupos espiralianos (Fig. 1c). Esto impide inferir los mecanismos ancestrales que controlan el patrón corporal en Annelida y Spiralia en general (Fig. 1c), y por lo tanto se desconoce si el papel de organización axial de ERK1/2 es una innovación de moluscos o un mecanismo de especificación del destino celular ancestral perdido en algunos autónomos. linajes de anélidos.

En este trabajo, estudiamos estratégicamente la especie Owenia fusiformis29,30 para determinar el papel de la señalización de ERK1/2 en un anélido condicional (Fig. 1c). Esta especie marina pertenece a Oweniida, el grupo hermano de todos los anélidos restantes31,32, y exhibe rasgos embrionarios considerados ancestrales de Annelida30,33. Por lo tanto, el estudio de O. fusiformis puede, en comparación con otros linajes de anélidos y espirales, ayudar a inferir rasgos ancestrales de este grupo y de Spiralia en general.

A diferencia de las especies con modo de desarrollo autónomo en el que el blastómero del linaje D que hereda los determinantes maternos es más grande, los cuatro cuadrantes embrionarios en los embriones con el modo condicional de hendidura en espiral son simétricos, lo que dificulta inferir identidades celulares durante el desarrollo temprano. Sin embargo, la célula que actúa como organizador embrionario en el cuadrante D difiere la progresión del ciclo celular en comparación con los blastómeros equivalentes en los cuadrantes A–C y muestra un enriquecimiento de ERK1/2 activo (es decir, desfosforilado) en algunos moluscos condicionales10,20 y supuestamente el anélido condicional Hydroides hexagonus20 (Fig. 1c). Por lo tanto, para determinar el linaje D e identificar un potencial organizador embrionario en O. fusiformis, primero caracterizamos la dinámica de división celular y los patrones de actividad de ERK1/2 en el polo vegetal desde la fertilización hasta el inicio de la gastrulación (6 h post fertilización, hpf ). En este anélido, la primera asimetría de escisión se produce con la aparición del cuarto cuarteto de micrómeros (células 4q) a ~4 hpf, cuando se forma un par de células 4q antes que las otras dos (Fig. 1a, b complementarias). Sin embargo, el polo vegetal permanece simétrico y las identidades de los cuadrantes embrionarios son imperceptibles a las 5 hpf (etapa de celoblastula; Fig. 1c complementaria). Sin embargo, con el inicio de la gastrulación a las 6 hpf30, todos menos uno de los blastómeros 4q se dividen (Fig. 1d complementaria). La celda 4q no dividida es más grande en esta etapa y solo se divide en dos celdas grandes después de la entrada durante la gastrulación temprana a las 7 hpf (Figura complementaria 1e, f). Por lo tanto, el signo morfológico más temprano de simetría bilateral en O. fusiformis ocurre con la formación y división diferida de un micrómero 4q, que se infiere que es la célula 4d en otros anélidos condicionales con dinámicas similares de división e ingreso de los blastómeros 4q34,35 ,36,37.

Para diseccionar los patrones de actividad de ERK1/2 y su conexión con los micrómeros 4q en O. fusiformis, utilizamos un anticuerpo de reacción cruzada contra la forma difosforilada activa de ERK1/2 (di-P-ERK1/2)20, 24 desde la fertilización hasta el inicio de la simetría bilateral y el micrómero 4q indiviso (6 hpf). Este anélido tiene un solo ortólogo ERK1/2 expresado en niveles bajos en ovocitos activos y hasta 4 hpf (~ 32 etapas de células), cuando aumenta su expresión y actividad (Fig. 2a-d complementaria). En este momento, la mayoría de los cuatro micrómeros apicales/animales exhiben una señal di-P-ERK1/2 enriquecida (Fig. 2a, b; Fig. 2c complementaria), que desaparece a las 5 hpf, cuando di-P-ERK se enriquece en en su lugar, un micrómero 4q (Fig. 2c, d; Fig. 2c complementaria). A las 6 hpf, la señal de di-P-ERK1/2 se enriquece en siete blastómeros, incluidos tres pares de micrómeros del segundo cuarteto y el micrómero 4q que rompe la simetría cuadri-radial del embrión al diferir la escisión a 7 hpf (Fig. 2e, f; Fig. 2c complementaria). Juntos, nuestros datos respaldan que el micrómero 4q enriquecido con di-P-ERK1/2 a las 5 y 6 hpf en O. fusiformis y que difiere la escisión hasta las 7 hpf es la celda 4d (Fig. 2g), que se asemeja a la condición observada en el anélido H. hexagonus20 y muchos moluscos gasterópodos19,20,21,22,24.

Proyecciones a–f z-stack de embriones de montaje completo a las 4, 5 y 6 h después de la fertilización (hpf) teñidas contra ERK1/2 difosforilado activo (di-P-ERK1/2; amarillo) y núcleos (DAPI). A las 4 hpf (a, b), di-P-ERK1/2 se enriquece en cuatro células animales (1q111). A las 5 hpf (c, d), la señal de di-P-ERK1/2 está en una sola celda (el micrómero 4d; consulte la Fig. 1 complementaria), mientras que el ERK1/2 activo se produce en seis celdas del linaje 2a-c y la celda 4d a 6 hpf (e, f). Los recuadros en a–f son imágenes de campo claro de las pilas correspondientes. g Representación esquemática del polo vegetal durante el nacimiento y primera división del cuarto cuarteto de micrómeros en O. fusiformis. En rojo, señal di-P-ERK1/2 enriquecida. En d y f, los asteriscos apuntan al polo animal. Las descripciones de a–f se basan en al menos diez embriones por etapa, de un mínimo de dos réplicas biológicas. Las barras de escala son de 50 μm. Los dibujos en g no están a escala.

Para examinar más a fondo el papel de la señalización de ERK1/2 durante el desarrollo de O. fusiformis, tratamos embriones con brefeldina A (BFA), un inhibidor del tráfico de proteínas intracelulares utilizado anteriormente para bloquear la inducción del organizador en otros embriones de hendidura en espiral;29, 38 y U0126, un inhibidor selectivo de la desfosforilación de MEK1/2 y ERK1/224,39 (Fig. 3a). Para ambos fármacos, el tratamiento desde la fertilización (~0,5 hpf) hasta 5 hpf, cuando di-P-ERK1/2 se enriquece en 4d, bloquea eficazmente la activación de ERK1/2 (Fig. 3b; Fig. 3a complementaria; Tabla complementaria 2) y provoca la pérdida de simetría bilateral, estructuras posteriores (p. ej., setas e intestino posterior) y músculos larvales de una manera dependiente de la dosis hasta el 100 % de los embriones a una concentración de 10 µM (Fig. 3c; Fig. 3b complementaria; Tablas complementarias 3 y 4). En comparación con las muestras de control, los embriones tratados con 0,5–5 hpf carecen de un penacho apical completamente formado y de un órgano apical, lo que muestra una expresión ectodérmica reducida del marcador de órgano apical six3/6 y menos células apicales positivas para el marcador neuronal sinaptotagmina-1 (syt1)30 ( Figura 3d). Además, los embriones tratados carecen de expresión de marcadores3 del intestino posterior (cdx) y mesodérmico del tronco (giro), muestran una expresión ampliada del gen marcador ectodérmico oral gsc3 alrededor de la abertura intestinal única (Fig. 3d; Fig. 3c complementaria) y retienen la expresión de el marcador endodérmico del intestino medio GATA4/5/6b3 (Fig. 3c complementaria). Consideramos este fenotipo como radializado anteroventralmente (o Radial; Tabla complementaria 3). Por lo tanto, se requiere la activación de la señalización de ERK1/2 en la célula 4d en la etapa de celoblastula para especificar y desarrollar estructuras posteriores y dorsales durante la embriogénesis de O. fusiformis, aunque la inhibición de la actividad de ERK1/2 en 1q111 (a las 4 hpf) también podría contribuir al fenotipo de órgano apical reducido.

un dibujo esquemático de la cascada de señalización ERK1/2 y el modo de acción de Brefeldin A (BFA) y U0126. b Inmunotinción de montaje completo contra di-P-ERK1/2 (los paneles principales son vistas laterales; los recuadros son vistas vegetales). Los tratamientos con BFA y U0126 desde 0,5 h después de la fertilización (hpf) hasta 5 hpf evitan el enriquecimiento de di-P-ERK1/2 en la celda 4d. c Proyecciones laterales en z-stack de control y larvas BFA/U0126 de 24 hpf tratadas de 0,5 a 5 hpf. Los recuadros en los embriones tratados son vistas ventrales. Los cilios se marcan con tubulina antiacetilada y actina F con faloidina. d Hibridación in situ de montaje completo en control y larvas tratadas con U0126 (0,5–5 hpf). e Representación esquemática de las ventanas de tratamiento farmacológico analizadas. El número de casos se muestra a la derecha de cada barra especificando el intervalo de tiempo. f Distribución y porcentajes de los fenotipos larvarios observados para cada ventana y condición experimental (WT, tipo salvaje; R, radial). g Caracterización fenotípica del fenotipo larvario comprimido obtenido después del tratamiento con BFA desde 0,5 hpf hasta 3-4 hpf. Primera fila, proyecciones laterales de la pila z de larvas teñidas con DAPI (núcleos), faloidina (actina F) y tubulina acetilada (cilios). Filas inferiores, vistas laterales de hibridación in situ de montaje completo contra marcadores ectodérmicos apicales (six3/6), ectodérmicos orales (gsc), intestino posterior (cdx) y mesodérmicos (torsión). Las larvas comprimidas son normales pero tienen un órgano apical reducido y su blastocele larvario está de alguna manera obliterado. En b–d y g, los asteriscos apuntan al polo apical. Para b, la Tabla complementaria 2 informa números detallados. Para c–d y g, los datos complementarios 1 informan números detallados. Para e y f, la Tabla complementaria 5 informa números detallados. Los dibujos esquemáticos no están a escala. ao órgano apical, anus, ch chaetae, mg midgut, mo boca, pt prototroch. Las barras de escala son de 50 μm.

Para diseccionar el momento exacto de la inducción y la actividad de ERK1/2 durante la escisión de O. fusiformis, tratamos embriones con BFA/U0126 10 µM en ventanas de tiempo superpuestas desde la fertilización hasta la gastrulación temprana (Fig. 3e, f; Tabla complementaria 5). El bloqueo de la secreción de proteínas con BFA desde la fertilización hasta la etapa de 8 células no afecta el desarrollo normal. Sin embargo, el tratamiento con BFA entre la etapa de 8 células y 4 hpf da como resultado larvas con todos los puntos de referencia morfológicos de una larva de mitraria típica y expresión normal de marcadores específicos de tejido, pero con una morfología comprimida a lo largo del eje apical-ventral, quizás debido a una alteración de la formación del blastocele larvario (Fig. 3g; Fig. 3c complementaria). Solo el tratamiento con BFA de 4 a 6 hpf y, por lo tanto, abarca la formación de 4d, provoca un fenotipo radial, y los tratamientos después de 5 hpf son letales (Fig. 3e, f; Fig. 3c complementaria). Todo esto sugiere que un posible evento inductivo que impulse la activación de ERK1/2 en 4d debería ocurrir entre 4 y 5 hpf, justo durante la formación de micrómeros 4q (Fig. 1a-c complementaria). Inesperadamente, la prevención de la difosforilación de ERK1/2 con U0126 desde la etapa de 2 células hasta las 4 hpf, cuando podría comenzar este evento de inducción, también provoca un fenotipo radial (Fig. 3e), con solo ligeras diferencias entre ciertos puntos de tiempo (Fig. Suplementaria 2c). Por lo tanto, la actividad de ERK1/2 es esencial para el patrón embrionario normal y el desarrollo posterodorsal durante la mayor parte de la escisión en espiral en O. fusiformis. Sin embargo, la combinación de los fenotipos BFA y U0126 sugiere que ERK1/2 podría actuar de manera autónoma desde la etapa de 2 células hasta las 4 hpf, mientras que requiere el tráfico de proteínas intracelulares y, por lo tanto, potencialmente señales de comunicación inductivas de célula a célula para su enriquecimiento en 4d.

Para investigar los mecanismos a través de los cuales ERK1/2 controla el desarrollo posterodorsal en O. fusiformis, a continuación planteamos la hipótesis de que el perfil de la expresión génica de todo el genoma en embriones tratados con BFA y U0126 descubriría reguladores aguas arriba y objetivos aguas abajo de la actividad de ERK1/2. Por lo tanto, tratamos los embriones con BFA 10 µM o U0126 10 µM desde la fertilización hasta las 5 hpf (para cubrir las fases autónoma y condicional de la actividad de ERK1/2) y realizamos perfiles de transcriptoma de ARN-seq en embriones tratados y controlados recolectados justo después del parto. Enriquecimiento de P-ERK1 / 2 en la celda 4d (coeloblastula; 5.5 hpf) y en la etapa larvaria (Fig. 4a; Fig. Suplementaria 4a, b). Los análisis de expresión diferencial revelaron 90 y 268 genes expresados ​​diferencialmente (DEG; log2 (cambio de pliegue) < -1,5 y valor de p ajustado por tasa de descubrimiento falso < 0,05) en celoblastulas y larvas tratadas con BFA, respectivamente, y 132 (celoblastula) y 373 (larva) DEG después del tratamiento con U0126 (Fig. 4b). Al considerar todas las comparaciones y eliminar las redundancias, detectamos un total de 628 DEG, 414 (65,92 %) de los cuales estaban funcionalmente anotados y enriquecidos en términos de ontología genética relacionados con la regulación de la transcripción, el desarrollo y la especificación del destino celular (Datos complementarios 2). La mayoría de estos DEG estaban regulados a la baja (Fig. 4b, c; Fig. 4c, d complementaria) y solo tres DEG (cdx, fer3 y foxH) aparecieron sistemáticamente regulados a la baja en ambos fármacos y en los dos puntos de tiempo de desarrollo (Fig. 4b; Suplementario Figura 4d). En particular, los objetivos aguas abajo de U0126 y BFA mostraron una superposición limitada (Fig. 4d complementaria), probablemente como resultado de la diferente especificidad de los dos tratamientos, con BFA dirigido ampliamente al tráfico intracelular y la secreción de proteínas y, por lo tanto, mostrando potencialmente más efectos fuera del objetivo que U0126. Sin embargo, nuestro enfoque reveló un conjunto seguro y relativamente pequeño de genes cuya expresión depende en gran medida de la actividad de ERK1/2.

un diseño experimental para colecciones de RNA-seq. Las barras de colores sólidos muestran los tratamientos del período de control (DMSO), brefeldina A (BFA) y U0126. Los círculos rojos indican la recolección de muestras en la celoblastula (5,5 h después de la fertilización, hpf) y la etapa larval (24 hpf). b Número de genes expresados ​​diferencialmente (DE) en diferentes condiciones y comparaciones (indicado por puntos blancos y grises en la parte inferior; los puntos grises resaltan las condiciones incluidas en la comparación), donde las barras rojas son genes regulados a la baja y las barras azules son genes regulados al alza. c Gráficas de volcanes (prueba de Wald bilateral) para celoblastula tratada con BFA y U0126. Los puntos rojos muestran genes DE, con genes candidatos etiquetados para cada comparación. d Evolución temporal y espacial de la expresión de los genes candidatos afectados por la especificación incorrecta de 4d, que generalmente se asocian con el desarrollo apical/anterior, chaetae/posterior, intestino posterior y mesodermo. La primera columna ("Condición") indica el tratamiento (BFA o U0126) y la etapa de desarrollo (CB coeloblastula, larva L) en la que cada uno de los genes candidatos se expresa de manera diferencial (cada condición resaltada con un color diferente). El mapa de calor central muestra valores de expresión de puntuación z normalizados para cada gen. La línea punteada vertical destaca el momento de la especificación 4d. La tercera columna muestra imágenes de hibridación in situ de montaje completo de un subconjunto de estos 22 genes candidatos en la celoblastula (5 hpf), la gástrula (9 hpf) y las etapas larvales (24 hpf). e Solo tres de los genes candidatos (cdx, foxH y fer3) están regulados a la baja en todas las etapas y comparaciones de tratamientos. La validación mediante hibridación in situ demuestra que la expresión de estos genes se pierde después del tratamiento farmacológico. En d y e, las imágenes para cdx en la etapa de celoblastula y larva, condición de control, son las mismas. En d y e, los asteriscos apuntan al polo apical/animal y las puntas de flecha a los dominios de expresión. Los mapas de calor en d se generaron a partir de un curso de tiempo de desarrollo generado a partir de dos réplicas biológicas, y la expresión in situ se realizó con un mínimo de dos réplicas biológicas. Para c y e, los datos complementarios 1 informan números detallados. Las barras de escala son de 50 μm. Los dibujos esquemáticos no están a escala. bp blastoporo, mo boca.

Para validar que los DEG se ven afectados por la especificación incorrecta de 4d, seleccionamos 22 DEG para realizar más análisis de expresión génica (Fig. 4d; Tabla complementaria 6), incluida una variedad de factores de transcripción que son marcadores de células y tipos de tejidos particulares (p. ej., seis3/ 6, gsc, cdx, AP2, foxQ2), necesarios para el desarrollo del mesodermo (p. ej., twist, hand2, foxH) y neurogénesis (p. ej., POU4, irxA), ligandos Wnt (wnt1, wntA y wnt4), moduladores de TGF-β (noggin y BAMBI), y componentes de señalización Notch (delta y tipo muesca). Los datos de RNA-seq específicos de etapa que cubren 12 puntos de tiempo de desarrollo33, desde el ovocito no fertilizado hasta la larva madura, confirmaron que la expresión de todos los genes candidatos aumenta en el momento o justo después de la especificación 4d y el enriquecimiento de di-P-ERK1/2 en esta celda (Fig. 4d). Estos genes se expresan en los dominios apical/anterior (noggin, BAMBI, foxQ2, POU4, six3/6, gsc), la punta larval posterior y las setas (fer3, lhx1/5, wnt1, notch, msx2-a, irxA, AP2 , wnt4, delta), el intestino posterior (cdx) o derivados mesodérmicos (foxH, rhox, wntA, POU3, hand2, twist) (Fig. 4d; Fig. complementaria 5a-g). El análisis de la expresión de estos genes en embriones de control y tratados en las etapas de celoblastula (5.5 hpf) y larva (24 hpf) confirmó que los dominios de expresión de estos genes desaparecen después del tratamiento con BFA o U0126 (Fig. 4e; Fig. 5a complementaria) –g; Datos complementarios 1; Tabla complementaria 7), validando así nuestro enfoque de RNA-seq. En conjunto, nuestros hallazgos descubren un conjunto de genes co-regulados que actúan aguas abajo de la señalización de ERK1/2 y que están involucrados en el desarrollo de estructuras apicales, posterodorsales y mesodérmicas en O. fusiformis.

Nuestro estudio de RNA-seq y el cribado de genes candidatos revelaron nueve genes expresados ​​en el polo vegetal a las 5,5 hpf y cuya expresión se vio afectada por la inhibición directa de la desfosforilación de ERK1/2 (cdx, delta, foxH, wnt1, wntA, rhox, fer3 y AP2) o afectar el tráfico y la secreción de proteínas intracelulares (gsc) (Fig. 4e; Fig. 5a, c, e complementarias). Ninguno de estos genes se expresa a las 5 hpf, al inicio de la actividad de ERK1/2 en el micrómero 4d (Fig. 5a). En cambio, el marcador endodérmico temprano GATA4/5/6a3, cuya expresión no se ve afectada por el tratamiento con BFA y U0126, se expresa simétricamente en la placa gastral (incluido 4d) en esta etapa (Fig. 5a; Fig. 6a complementaria). A las 5,5 hpf, media hora después de la activación inicial de la señalización de ERK1/2 en 4d, el polo vegetal adopta un patrón simétrico bilateral, pero solo dos de los genes dependientes de ERK1/2 (cdx y delta) se expresan en el micrómero 4d (Fig. 5b, c). En particular, estos se expresan en la célula 4d en otros embriones en espiral (Tabla complementaria 8), lo que respalda nuestra inferencia de linaje celular basada en la progresión del ciclo celular, la información de posición celular y la actividad ERK1/2. El gen ParaHox cdx, que se detecta en el intestino posterior de O. fusiformis en la etapa larval3 (Fig. 4e; Fig. complementaria 6b), se expresa en 4d y luego en las dos células hijas de 4d (es decir, la izquierda y mesentoblastos derechos, o células ML y MR), que permanecen sin dividir y continúan exhibiendo di-P-ERK1 / 2 activo hasta la etapa de gástrula (Fig. 6a, b; Fig. 1f complementaria). De manera similar, el delta del ligando Notch (Fig. 6c, d complementaria) se expresa en 4d a 5.5 hpf, pero también en la mayoría de los descendientes de 1d en el polo animal, más micrómeros animales y derivados ectodérmicos de C- y D- cuadrante en el polo vegetal (Fig. 5b, c; Fig. 5a complementaria). Para investigar cómo ERK1/2 podría controlar la activación de cdx y delta, utilizamos el Ensayo de cromatina accesible por transposasa utilizando datos de secuenciación (ATAC-seq) a 5 hpf para identificar motivos de factores de transcripción presentes en regiones de cromatina accesibles asociadas con estos dos genes (Fig. .5d). Estos incluyen motivos de reguladores transcripcionales que se sabe que están modulados por la fosforilación de ERK1/2, como los factores ETS, RUNX y GATA18. Por lo tanto, la defosforilación de ERK1/2 en 4d parece controlar la actividad de los reguladores transcripcionales que inducen destinos posteriores (cdx) y los genes de comunicación célula-célula (delta).

a, b Hibridación in situ de montaje completo de un subconjunto de genes (dependientes e independientes de ERK1/2) que modelan el polo vegetal a las 5 y 5,5 h después de la fertilización (hpf), respectivamente. A 5 hpf (a), cuando se especifica el 4d (dibujo de la izquierda) solo se expresa el marcador endodérmico GATA4/5/6a (incluido en la celda 4d, punta de flecha). A las 5,5 hpf (b), cdx y delta se expresan en la célula 4d (puntas de flecha) y los micrómeros de los cuadrantes C y D que rodean la célula 4d comienzan a expresar una serie de genes implicados en el desarrollo posterodorsal y mesodérmico (foxH, wnt1, wntA , rhox, fer3 y AP2). El gen ectodérmico oral anterior gsc, que no está directamente regulado por la activación de ERK1/2, también comienza a expresarse en este momento (puntas de flecha). En b, la parte superior sin procesar son hibridaciones colorimétricas in situ y la fila inferior son proyecciones de pila z de hibridaciones fluorescentes in situ contrateñidas para núcleos (con DAPI) y bordes celulares (con inmunohistoquímica de tubulina acetilada). En ayb, todos los paneles son vistas vegetales. Las descripciones de ayb se basan en al menos diez embriones por etapa, de un mínimo de dos réplicas biológicas. c Representación esquemática del polo vegetal y los micrómeros de los cuadrantes C y D alrededor del blastómero 4d que representa los dominios de expresión génica (en verde) y las identidades celulares inferidas de los genes estudiados a 5,5 hpf. Las barras de escala son de 50 μm. Los dibujos no están en escala.

a proyecciones de pila z (vistas vegetales) de inmunohistoquímica de montaje completo contra ERK1/2 difosforilado (di-P-ERK1/2) de 7 a 9 h después de la fertilización (hpf). El micrómero 4d se escinde a las 7 hpf en las células hijas MR y ML (Fig. 1 complementaria). b Proyección de pila z (vista vegetal) de una hibridación in situ de montaje completo fluorescente contra cdx (amarillo) en la etapa de gástrula (9 hpf), contrateñida con DAPI (núcleos) y tubulina acetilada (límites celulares). c Distribución de motivos de factores de transcripción accesibles en regiones de cromatina abierta alrededor de los loci cdx (parte superior) y delta (parte inferior) a 5 hpf. El azul oscuro y el azul claro representan las dos réplicas de ATAC-seq. d Proyecciones de pila z (vistas vegetales) de hibridaciones in situ de montaje completo fluorescentes contra foxH de 6 a 9 hpf (es decir, gastrulación), contrateñidas con DAPI (núcleos), tubulina acetilada (límites celulares) y fosfo-Histone3 (rojo; marcador de mitosis). e Dibujos esquemáticos de las células que rodean 4d y MR/ML durante la gastrulación, que representan la expresión de foxH basada en d. f Número de contactos celulares para cada uno de los micrómeros 4q a 5,5 hpf basado en el análisis de ocho embriones teñidos para actina de membrana. La célula 4d establece más contactos celulares que cualquier otro micrómero 4q al comienzo de la gastrulación. g Proyecciones de pila z (vistas vegetales) de hibridaciones in situ de montaje completo fluorescentes contra gsc y AP2 a 5,5 hpf, contrateñidas con DAPI (núcleos) y tubulina acetilada (límites celulares). La especificación incorrecta de 4d expande el gen ectodérmico oral gsc y perjudica la expresión del gen posterior AP2, ya que todos los micrómeros 4q (asteriscos) se comportan de manera similar. La expresión de gsc se pierde en los embriones tratados con brefeldina A (BFA), lo que sugiere que podría requerir señales inductivas. En d y g, las flechas y puntas de flecha apuntan a dominios de expresión. Las descripciones de a, b y d se basan en al menos diez embriones por etapa, de un mínimo de dos réplicas biológicas. Para g, la Tabla complementaria 9 informa números detallados. Las barras de escala son de 50 μm. Los dibujos esquemáticos no están a escala. ar archenteron, bl blastopore.

Los otros seis genes dependientes de ERK1 / 2 adicionales modelan los micrómeros que rodean 4d a 5.5 hpf, definiendo los dominios mesodérmico y ectodérmico posterior (Fig. 5b, c). El factor de transcripción foxH (Fig. 6e complementaria), que regula el desarrollo del mesodermo durante la gastrulación en embriones de vertebrados40,41,42,43, se detecta en cuatro micrómeros adyacentes a 4d (Fig. 5b, c), lo que podría contribuir al ectomesodermo lateral según a estudios de rastreo de linaje en el anélido Urechis caupo37. Durante la gastrulación, estas células foxH+ experimentan una división celular asimétrica en planos de división ortogonales para terminar rodeando las células MR y ML (Fig. 6d, e). Más tarde, durante el alargamiento axial, la expresión de foxH forma un patrón posterior en forma de V de supuestos precursores mesodérmicos, que se desvanecen en las etapas larvarias (Fig. 6b complementaria). Los ligandos wnt1 y wntA (Fig. 6f complementaria), expresados ​​en la región posterior y el cuadrante D durante el desarrollo en el anélido Platynereis dumerilii44, se expresan en dos columnas simétricas bilaterales de micrómeros y wntA también se detecta en dos micrómeros de cuadrante D adicionales (Fig. 5b, c). El homeobox rhox (Fig. 6g complementaria), que se expresa en células germinales primordiales masculinas y femeninas en vertebrados45, se detecta en dos micrómeros vegetales en el cuadrante D (Fig. 5b, c) y luego en dos pequeñas células dentro del blastocele en la gástrula (Fig. 5e complementaria). Los factores de transcripción fer3 y AP2 se expresan en dos micrómeros individuales y en un dominio ectodérmico posterior más amplio, respectivamente, quedando restringidos a un pequeño dominio de expresión en o cerca del saco quetal posterior de la larva (Fig. 5b, c; Fig. 5c complementaria). y 6b). En particular, la célula 4d, que tiene un tamaño de célula más grande que los otros micrómeros 4q porque no se divide a 5,5 y 6 hpf (Fig. 1 complementaria), establece contactos casi dobles directos célula-célula con las células circundantes, incluida la mayoría de las células que expresan foxH, wnt1, wntA, rhox y AP2—que cada una de las células hijas de 4a–c (Fig. 6e). Por lo tanto, estos resultados respaldan un papel inductivo probable del 4d en la definición de los destinos mesodérmico y posterodorsal, aunque se requieren estudios de ablación celular y/o trasplante celular para validar experimentalmente esta hipótesis.

El gen homeobox gsc es el único candidato expresado fuera del cuadrante D a las 5,5 hpf, y se detecta en un dominio en forma de U de micrómeros de los cuadrantes A, B y C que ocupan el borde blastoporal anterolateral prospectivo (Fig. 5b, c) . La expresión de gsc es independiente de la actividad de ERK1/2, consistente con su ubicación fuera del cuadrante D, pero se regula a la baja después del tratamiento con BFA (Datos complementarios 1). En consecuencia, la expresión de gsc desaparece en las celoblastulas tratadas con BFA, mientras que la inhibición de la actividad de ERK1/2 con U0126 expande los dominios de gsc, que se detecta en todos los cuadrantes embrionarios de forma radial (Fig. 6f; Tabla complementaria 9). De hecho, en los embriones inhibidos por ERK1/2, todos los micrómeros 4q se escinden en 4q1 y 4q2, ya que ningún 4q se convierte en la célula 4d (Fig. 6f). Por lo tanto, todos los cuadrantes adoptan destinos anteroventrales (gsc), evitando la expresión de genes marcadores posteriores como AP2 (Fig. 6f; Tabla complementaria 9). Estos resultados demuestran que el fenotipo radial observado después de U0126 es una consecuencia de la especificación incorrecta de la celda 4d, y no el resultado de que el cuadrante D se haya especificado pero no se haya desarrollado más. Además, estos datos también demuestran que la especificación de la célula 4d a través de la actividad de ERK1/2 reprime los destinos anteriores, como se muestra al limitar la expresión de gsc.

La regulación positiva del delta del ligando de Notch en 4d después de la activación de ERK1/2 sugiere que el papel de 4d en la promoción del desarrollo posterodorsal podría ocurrir mediante la comunicación directa célula-célula mediada por la vía de señalización de Notch. Para probar esta hipótesis, tratamos embriones antes y después de la especificación de 4d con la molécula pequeña LY411575, que es un inhibidor selectivo de la gamma-secretasa que escinde el dominio intracelular activo de Notch tras la activación de Notch por Delta46 (Fig. 7a, b) . Las larvas que crecen a partir de embriones tratados con LY411575 desde la fertilización hasta las 5 hpf exhiben un fenotipo normal, con una simetría bilateral obvia y una organogénesis normal (Fig. 7b-e; Tabla complementaria 10). Sin embargo, la inhibición de la vía de Notch a partir de 5 hpf, cuando la actividad de ERK1/2 especifica la célula 4d, en adelante da como resultado larvas con simetría bilateral, un intestino pasante con una boca completamente anteriorizada, un órgano apical, pero tejidos posterodorsales más cortos, un fenotipo que llamar 'rechoncho' (Fig. 7b, c, f; Tabla complementaria 10). En consecuencia, estas larvas expresan gsc en el ectodermo oral anterior y tienen un intestino posterior corto que expresa cdx (Fig. 7g; Tabla complementaria 11). Por lo tanto, el fenotipo 'rechoncho' difiere del radial observado al inhibir ERK1/2 en que las identidades axiales se especifican en el primero, pero solo los destinos anteroventrales en el último (Tabla complementaria 3). En particular, el ectodermo posterodorsal de la gástrula expresa un ligando similar a una muesca y, como se observa para delta, su expresión está regulada por la actividad de ERK1/2 (Fig. 4d; Fig. 5f complementaria). Juntos, nuestros hallazgos respaldan que la activación de ERK1/2 en la célula 4d facilita la señalización de Notch en esta y en las células posterodorsales circundantes, que es totalmente necesaria para el desarrollo normal de las estructuras posteriores y dorsales. Sin embargo, estudios posteriores aclararán la red reguladora de genes exacta que conecta la señalización de ERK1/2 y Notch para controlar el desarrollo axial en O. fusiformis.

un Dibujo esquemático de la vía de señalización Notch-Delta, con el ligando Delta expresado en la célula 4d (ver Fig. 5b) y un receptor Notch en sus células vecinas (Fig. 4d). b Representación esquemática de las dos ventanas de tratamiento farmacológico realizadas en este estudio (a la derecha de cada barra se muestra el número de casos especificando el intervalo de tiempo). Para evaluar el papel de la vía de señalización de Notch después de la regulación positiva delta en 4d, tratamos embriones antes y después de su especificación. c Distribución y porcentajes de los fenotipos larvales observados para cada ventana y condición experimental (WT, wild type). Proyecciones d z-stack de control y embriones tratados con LY411575 (de 0 a 5 hpf) teñidos con DAPI (núcleos) y tubulina acetilada (AcTub; cilios). Los embriones de control y tratados muestran una morfología normal. e Vistas laterales de hibridación in situ de montaje completo de marcadores para tipos de células neurales apicales (syt1; sinaptotagmina-1), ectodermo oral (gsc) y tejidos derivados de 4d e intestino posterior (cdx) en una condición de tratamiento como en d. El control y las larvas de los embriones tratados muestran patrones de expresión génica normales. Los recuadros son vistas ventrales y las flechas apuntan a los dominios de expresión. f Proyecciones z-stack de control y embriones tratados con LY411575 (de 5 a 25 hpf) teñidos con DAPI (núcleos) y tubulina acetilada (AcTub; cilios). Las larvas de los embriones tratados exhiben simetría bilateral y un órgano apical normal, pero tienen un lado posterodorsal reducido, con un intestino posterior más corto/anormal y una región quetal subdesarrollada. Llamamos a este fenotipo "rechoncho". e Vistas laterales de hibridación in situ de montaje completo de marcadores para tipos de células neurales apicales (syt1; sinaptotagmina-1), ectodermo oral (gsc) y tejidos derivados de 4d e intestino posterior (cdx) en una condición de tratamiento como en f. Los recuadros son vistas ventrales y las flechas apuntan a los dominios de expresión. En d-g, los asteriscos marcan el polo anterior/apical. Las descripciones de b se basan en al menos diez embriones por etapa, de un mínimo de dos réplicas biológicas. Para b – g, la Tabla complementaria 11 informa números detallados. Las barras de escala son de 50 μm. ch chaetae, hg intestino posterior, mg intestino medio, mo boca, pt prototroch.

En embriones de vertebrados, la señalización de FGF mediada por la actividad de ERK1/2 regula la expresión de cdx y delta en el intestino posterior en desarrollo y el mesodermo presomítico durante la elongación del tronco posterior47. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la señalización de FGF podría ser el regulador aguas arriba que impulsa la actividad de ERK1 / 2 en 4d en O. fusiformis (Fig. 8a), que también se requiere para inducir la expresión de cdx y delta y especificar el progenitor mesodérmico del intestino posterior y del tronco. Owenia fusiformis tiene un solo receptor de FGF (FGFR; Fig. 7a complementaria) con una alta conservación de aminoácidos en residuos funcionales clave en comparación con el ortólogo FGFR1 humano (Fig. 7b complementaria). Si bien se regula transcripcionalmente al alza en la etapa de gástrula y parece expresarse principalmente en derivados mesodérmicos de la gástrula en adelante (Fig. 7c, d complementarias), el FGFR parece expresarse débilmente en la placa gastral en la etapa de celoblastula en O. fusiformis (Fig. 8b ), como también se observa en braquiópodos y foronídeos48. En esta etapa, los ligandos de FGF solo se expresan débilmente (Fig. 7c complementaria) y no se detectan mediante hibridación in situ. El tratamiento con SU5402 30 µM, un inhibidor selectivo de la fosforilación y activación de FGFR49 (Fig. 8a), evita el enriquecimiento de di-P-ERK1/2 en la célula 4d en el 96 % de los embriones tratados a las 5 hpf (Fig. 8c; Fig. complementaria). 7e). De hecho, el tratamiento con SU5402 durante la especificación del micrómero 4d (4–6 hpf y 3–7 hpf; Fig. 6c; Tabla complementaria 12) da como resultado un fenotipo anteriormente radializado, con embriones que se desarrollan en larvas que carecen de expresión posterior (intestino posterior y cdx). ) y estructuras mesodérmicas reducidas (músculos y expresión de torsión) y que muestran destinos ectodérmicos orales (gsc) gastados radialmente (Fig. 8g; Tabla complementaria 3). Por tanto, desde una perspectiva morfológica y de marcadores génicos, este fenotipo radial es como el obtenido tras inhibir la desfosforilación de ERK1/2 con U0126 y BFA. Por el contrario, el tratamiento antes del enriquecimiento con di-P-ERK1/2 en 4d (3–5 hpf) provoca un fenotipo ligeramente comprimido (Fig. 6f complementaria), similar también al observado al bloquear el tráfico de proteínas intracelulares con BFA en puntos de tiempo equivalentes . Por lo tanto, la inhibición de FGFR bloquea la activación de ERK1/2 y fenocopia el efecto de U0126 y BFA (Fig. 3c), lo que sugiere que la actividad de señalización de FGF es anterior y necesaria para la especificación 4d en O. fusiformis.

un dibujo esquemático de la vía de FGFR intracelular corriente abajo. El fármaco SU5402 inhibe específicamente los receptores tirosina quinasa del tipo FGF/VEGF, que pueden señalizar a través de la cascada de señalización ERK1/2. b Hibridación in situ de montaje completo para FGFR y VEGFR en la etapa de coeloblastula en O. fusiformis. El FGFR se expresa débilmente en la placa gastral en el momento del rediseño posterior instruido en 4 días. Sin embargo, VEGFR, que el tratamiento con SU5402 también puede inhibir, no se expresa en esta etapa. c Inmunohistoquímica de montaje completo contra ERK1/2 difosforilado (di-P-ERK1/2). Los embriones tratados con SU5402 pierden el enriquecimiento de ERK1/2 en un micrómero vegetal a las 5 h después de la fertilización (hpf). Las imágenes principales son vistas laterales y los recuadros son vistas vegetales. d Representación esquemática de las ventanas de tratamiento farmacológico realizadas en este estudio, dirigidas al período de especificación 4d (5 hpf). El número de casos se muestra a la derecha de cada barra especificando el intervalo de tiempo. e Distribución y porcentajes de los fenotipos larvales observados para cada ventana y condición experimental (WT, wild type). f Vistas laterales de proyecciones de pila z de control y embriones tratados con 4–6 hpf SU5402 fijados en la etapa larvaria y teñidos con DAPI (núcleos), faloidina (actina F) y tubulina acetilada (cilios). Las larvas tratadas muestran una fenocopia del fenotipo larvario radial U0126. A la izquierda, diagramas esquemáticos de vistas laterales de los controles y fenotipos de larvas radiales. g Vistas laterales de la hibridación in situ de montaje completo de cinco marcadores de tipo celular en el control y embriones tratados con 4–6 hpf SU5402 fijados en la etapa larvaria. Los embriones tratados se desarrollan en larvas radializadas con marcadores ectodérmicos orales expandidos (gsc), marcadores ectodérmicos apicales reducidos (six3/6), falta de genes mesodérmicos del intestino posterior y del tronco (cdx y twist, respectivamente) y marcadores normales del intestino medio (GATA4/5/6b) . Los recuadros son vistas ventrales. En b, c, fyg, los asteriscos apuntan al polo apical. Para d – g, la Tabla complementaria 12 informa números detallados. Las barras de escala son de 50 μm. Los dibujos esquemáticos no están a escala. an ano, ao órgano apical, ch chaetae, gp placa gastral, mg midgut, mo boca, pt prototroch.

Al combinar la caracterización funcional de las vías de señalización FGFR, ERK1/2 y Notch con la transcriptómica comparativa en O. fusiformis, un anélido con un modo de desarrollo condicional, nuestro estudio resuelve preguntas de larga data8 sobre los principios genéticos ancestrales que controlan el patrón corporal temprano durante la escisión en espiral. A diferencia de lo que se observa en los anélidos autónomos25,26,27,28, nuestro estudio proporciona pruebas convincentes de que la señalización de FGFR y ERK1/2 induce patrones axiales al especificar el micrómero 4d, el supuesto organizador embrionario, y activando genes aguas abajo involucrados en el mesodermo y posterodorsal. desarrollo en O. fusiformis (Fig. 9a). Como se observa en algunos moluscos10,20, la actividad de FGFR/ERK1/2 rompe la simetría cuatri-radial del embrión al retrasar la progresión del ciclo celular en la célula 4d (Fig. 2e; Fig. 6f; Fig. 1c, d complementaria), y por lo que detener la división celular, en lugar de promoverla18, parece ser una función general de la señalización de ERK1/2 en el contexto del patrón axial en embriones en espiral. Concomitantemente con la especificación de las identidades 4d y posterodorsal, los destinos anteriores se restringen a los cuadrantes A-C (Fig. 6f), lo que sugiere que las señales opuestas desconocidas, una que especifica destinos anteriores y otra que impulsa la especificación 4d a través de FGFR/ERK1/2, podrían actúan simultáneamente para definir la polaridad axial en O. fusiformis (Fig. 9a). Si bien se necesita más trabajo para identificar estas señales, planteamos la hipótesis de que la señal de anteriorización debe provenir de linajes celulares ya especificados en esas etapas (p. ej., el intestino medio y el órgano apical) o de determinantes maternos autónomos de células que se eliminan selectivamente del Cuadrante D según la especificación 4d. Además, la actividad de FGFR/ERK1/2 aumenta el delta del ligando Notch en la célula 4d y un receptor tipo muesca en el ectodermo posterodorsal de la gástrula (Fig. 4d; Fig. 5b) y, por lo tanto, la señalización Notch-Delta, una La vía ampliamente utilizada para ajustar los destinos celulares mediante la inhibición/inducción directa de célula a célula50 es uno de los efectores posteriores necesarios para el desarrollo posterodorsal y mesodérmico en O. fusiformis (Fig. 7f, g; Fig. 9a). En conjunto, nuestros hallazgos representan un modelo integral del desarrollo temprano de un anélido con hendidura en espiral condicional, sentando las bases para estudios adicionales que analizan la lógica reguladora exacta que sustenta el patrón corporal en este clado animal y en Spiralia en general.

un modelo esquemático de la actividad de FGFR/ERK1/2 en el micrómero 4d durante la escisión en espiral tardía en O. fusiformis. A las 4 h después de la fertilización (hpf), ERK1/2 difosforilado (di-P-ERK1/2) se enriquece en la mayoría de los micrómeros apicales (1q111). A las 5 hpf, una señal no identificada activa el receptor de FGF que defosforila ERK1/2 en el micrómero 4d. Esto activa cdx y delta en 4d (convirtiéndose en el precursor endomesodérmico), que también se correlaciona con 4d que detiene la progresión de su ciclo celular, ya que 4a–4c se escinde. Se requiere la activación de ERK1/2 en 4d para limitar los genes anteriores (p. ej., gsc) a los cuadrantes A-C, aunque la naturaleza exacta de esta interacción no está clara (líneas punteadas). Además, la actividad de ERK1/2 en 4d induce la expresión de una batería de genes en el cuadrante D y parte del cuadrante C que probablemente induce destinos laterales mesodérmicos y posterodorsales, y finalmente controla la elongación axial. A partir de esta etapa, se requiere la vía Notch-Delta para el desarrollo posterodorsal normal y podría contribuir a transmitir la actividad inductiva de la célula 4d a las células vecinas (línea de puntos). b Dibujos esquemáticos de embriones en el momento de la elongación axial anteroposterior en diferentes linajes bilaterales, con las interacciones entre FGFR, ERK1/2 y algunos de los genes candidatos identificados en este estudio en cada linaje representado a la izquierda. La participación similar de la activación de ERK1/2 en la especificación del organizador embrionario del cuadrante D en O. fusiformis y otros embriones de moluscos sugiere que la presencia de un organizador embrionario positivo para ERK1/2 es un rasgo ancestral compartido de la escisión en espiral. En términos más generales, la actividad de ERK1/2 induce la expresión de un conjunto de genes y vías de señalización que participan repetidamente en el patrón axial y el crecimiento del tronco posterior en embriones bilaterales. Si bien la organización axial y la formación de un centro de elongación posterior suelen estar desacopladas espacial y temporalmente en la mayoría de los linajes bilaterales, se integran en un solo proceso de desarrollo de actividad de organización embrionaria (es decir, la especificación del organizador embrionario del cuadrante D) en espiralianos. . Los dibujos no están en escala. A anterior, P posterior, D dorsal, V ventral.

La activación de FGFR/ERK1/2 en el blastómero 4d para controlar las identidades axiales y el patrón corporal en O. fusiformis es consistente con la actividad de ERK1/2 en la célula 4d en el anélido condicional H. hexagonus20. También refleja la condición observada en los moluscos, que a pesar de patrones algo diversos de actividad temprana de ERK1/210,21 (Tabla complementaria 1), generalmente usan ERK1/2 difosforilado activo para especificar y regular el organizador embrionario posterodorsal en el blastómero 3D o su célula hija 4d. De hecho, la contribución de 4d al intestino posterior en O. fusiformis también se observa en moluscos51,52, pero no en algunos anélidos autónomos53, y la señalización de Notch también podría respaldar el papel potencial de instrucción de la célula 4d en el molusco Tritia obsoleta54 (Fig. 9a ). Sin embargo, la especificación del cuadrante D y el organizador embrionario se basa en contactos directos célula-célula, y señales inductivas actualmente desconocidas, entre micrómeros animales y la posible célula 3D en moluscos55, lo que es poco probable que ocurra en O. fusiformis30 y otros anélidos condicionales29 con grandes blastoceles en el momento de la formación de los micrómeros 4q. En consecuencia, los reguladores aguas arriba de la actividad ERK1/2 en las células 3D/4d pueden diferir entre moluscos y anélidos y, por lo tanto, existe la posibilidad de que las similitudes en las vías intracelulares y las lecturas durante la especificación axial observadas entre estos dos grupos sean el resultado de evolución convergente. Sin embargo, un escenario alternativo, más parsimonioso, es que el papel de activación y patrón axial de ERK1/2 en la célula que actúa como organizador embrionario es homólogo a Annelida y Mollusca (Fig. 9b) y, por lo tanto, un rasgo fundamental de la escisión en espiral. La matriz de patrones ERK1/2 observados en anélidos autónomos26,27,28 (Tabla complementaria 1) representaría así pérdidas independientes de un organizador ERK1/2+ ancestral relacionado quizás con una transición a un modo autónomo de especificación del destino celular. En el futuro, una mejor comprensión de las redes reguladoras de genes aguas arriba que controlan la actividad de ERK1/2 en anélidos y moluscos ayudará a probar este escenario y diseccionar los mecanismos que promueven la variabilidad en la identidad celular del organizador embrionario en Spiralia.

En términos más generales, nuestro estudio descubre sorprendentes similitudes entre la cascada molecular que especifica el organizador embrionario y las identidades posterodorsales en espirales condicionales y los módulos genéticos que regulan el patrón axial y el crecimiento posterior en Deuterostomia y Ecdysozoa47,48,56,57,58 (Fig. 9b; Suplementario Tabla 13). Aunque las lógicas reguladoras exactas varían entre los principales linajes, y a veces incluso entre clados relacionados filogenéticamente, la actividad de ERK1/2 es central para el patrón dorsoventral en equinodermos, hemicordados y cordados, y junto con FGFR contribuye al crecimiento posterior en cordados, promoviendo la expresión de cdx y delta en el extremo posterior de la cola en crecimiento (Fig. 9b; Tabla complementaria 14 y referencias allí). De manera similar, la señalización de FGFR impulsa el patrón dorsoventral en un artrópodo, la araña Parasteatoda tepidariorum (Tabla complementaria 14). La vía de señalización Notch-Delta también está involucrada en el alargamiento posterior en hemicordados, cordados, artrópodos y controla las identidades posteriores y dorsoventrales en nematodos (Fig. 9b; Tabla complementaria 14 y referencias allí). Por lo tanto, los principios genéticos y de desarrollo antiguos y ampliamente conservados sustentan el modo condicional de especificación del destino celular en la escisión en espiral, lo que refuerza aún más la opinión de que este modo de desarrollo representa la condición ancestral en Spiralia11,12,13. Sin embargo, a diferencia de otras embriogénesis tempranas, la escisión en espiral, con su patrón estereotípico altamente único de divisiones celulares y desarrollo temprano con un número reducido de blastómeros, combina la instrucción de identidades axiales y desarrollo posterior temporal y espacialmente en una sola célula organizadora: la 3D/4d en moluscos y muy probablemente la celda 4d en anélidos (Fig. 9b). Cómo esta célula, y su función de patrón de instrucción conservada, promueve el desarrollo posterior de morfologías adultas profundamente diferentes en Spiralia sigue siendo una pregunta abierta, que una investigación detallada de los módulos genéticos aguas abajo del organizador del cuadrante D en los linajes espiralianos ayudará a resolver.

Se recolectaron especímenes adultos de O. fusiformis Delle Chiaje, 1844 de la costa cerca de la estación biológica de Roscoff (Francia) durante la temporada reproductiva (mayo-julio). En el laboratorio, los animales se mantuvieron en agua de mar artificial (ASW) a 15 °C. Las fertilizaciones in vitro se realizaron como se describió anteriormente3,30 y los embriones se desarrollaron en recipientes de vidrio con ASW filtrada a 19 °C hasta la etapa embrionaria deseada.

Los embriones se trataron con brefeldina A (BFA; Sigma-Aldrich, n.° B7651), U0126 (Sigma-Aldrich, n.° U120), LY411575 (Sigma-Aldrich, n.° SML0506) o SU5402 (Sigma-Aldrich, n.° 572630). Todas las reservas de fármacos se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) y se diluyeron en ASW antes de su uso, con concentraciones de trabajo óptimas (10 µM para BFA y U0126, 100 µM para LY411575 y 30 µM para SU5402) establecidas después de la titulación inicial. Para todos los tratamientos farmacológicos, se usaron volúmenes equivalentes de DMSO como control negativo y, en todos los casos, los tratamientos se iniciaron ~0,5 h después de la fertilización (hpf), justo después de la fertilización y la extracción de esperma, o como se indica en cada figura. Los tratamientos se detuvieron lavando el fármaco con al menos tres lavados en ASW y los embriones se recolectaron para análisis posteriores o se criaron hasta el estado larvario. Las muestras recolectadas para inmunohistoquímica y análisis de expresión génica se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% en ASW durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Las larvas se relajaron en cloruro de magnesio al 8 % (MgCl2) antes de la fijación y se fijaron en PFA al 4 % en MgCl2 al 8 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la fijación, las muestras se lavaron varias veces con solución salina tamponada con fosfato (PTw) con Tween-20 al 0,1 % y se almacenaron en PTw a 4 °C para inmunohistoquímica o se deshidrataron al 100 % de metanol y se almacenaron a -20 °C para el montaje completo en hibridación in situ. Los embriones y larvas tratados y de control recolectados para los análisis de RNA-seq se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C antes de la extracción total de RNA.

El marcaje con actina F y la tinción de anticuerpos se realizaron como se describió previamente30, con la modificación de que las muestras recolectadas para la tinción anti-di-P-ERK1/2 se lavaron en PTw complementado con una dilución 1:100 de inhibidores de fosfatasa (Cell Signalling, #5872 ) después de la fijación. Los anticuerpos primarios de ratón anti-ERK1/2 fosforilado doble (Sigma-Aldrich, n.° M8159, 1:200) y α-tubulina anti-acetilada de ratón (clon 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, n.° MABT868, 1:500) ) se diluyeron en suero de cabra normal (NGS) al 5 % en solución salina tamponada con fosfato Triton X-100 al 0,1 % (PTx) y se incubaron durante la noche (ON) a 4 °C. Después de varios lavados en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % en PTx, las muestras se incubaron con un anticuerpo conjugado contra la peroxidasa de ratón (POD) (Millipore-Sigma, #11207733910, 1:100) o un anticuerpo conjugado AlexaFluor594 ( ThermoFisher Scientific, n.º A32731, 1:600) diluido en NGS al 5 % en PTx ON a 4 °C. Para las muestras incubadas con anticuerpo anti-ERK1/2 doblemente fosforilado de ratón y anticuerpo conjugado con POD anti-ratón, la señal se desarrolló utilizando diaminobencidina (DAB) (Vector Laboratories, n.° SK-4100) o un kit de amplificación de señal Tyramide (Akoya Biosciences, n.° NEL742001KT) ) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras desarrolladas con DAB se almacenaron en glicerol al 70 % y se contrastaron con marcador nuclear 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, ThermoFisher Scientific, n.º D3571, 1:1000). Las muestras para microscopía confocal de barrido láser (LSCM) se contrastaron con DAPI diluido en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 % en PTx durante 1 h a temperatura ambiente y se montaron en glicerol al 70 %.

El ARN total se extrajo usando el kit de minipreparación de ARN total Monarch (New England Biolabs, #T2010) y se usó para la preparación de la biblioteca de ARNm de cadena de Illumina. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina HiSeq 4000 en modo de salida de extremo emparejado de 75 bases, generando ~20 millones de lecturas por muestra. Las secuencias adaptadoras y las bases de baja calidad se eliminaron con Trimmomatic v.0.3659. Luego, las lecturas limpias se asignaron a la anotación del genoma de referencia de O. fusiformis33 (disponible en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos con el número de acceso GCA_903813345) utilizando Kallisto v.0.44.0 para generar recuentos de expresión génica60. Los análisis de expresión génica diferencial se realizaron de forma independiente para cada fármaco y se calcularon en comparaciones por pares de diferentes etapas y condiciones utilizando el paquete R DEseq2 v.1.38.061. El umbral de significación se ajustó a un valor de p ≤ 0,05 y un cambio de pliegue Log2 > 1,5 o <−1,5 (Datos complementarios 1). Los PCA y el agrupamiento jerárquico se trazaron utilizando los paquetes ggplot2 y pheatmap R, respectivamente. Los gráficos de volcán se obtuvieron con el paquete EnhancedVolcano, disponible en R. Los genes candidatos para análisis de expresión génica adicionales se seleccionaron en función de su expresión diferencial en ambos tratamientos farmacológicos (U0126 y BFA) o de su expresión altamente diferencial a 5,5 hpf en embriones tratados con U0126. Refinamos aún más nuestra selección en función de las categorías de Gene Ontology (GO) (Datos complementarios 2), centrándonos en los factores de transcripción y los genes del desarrollo (Tabla complementaria 6).

Para el mapeo GO, los términos GO de los genes expresados ​​diferencialmente asociados con cada comparación se extrajeron de la anotación del genoma de referencia de O. fusiformis33 (disponible en el repositorio https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Los análisis de enriquecimiento de GO se implementaron utilizando el paquete GOseq R, corrigiendo el sesgo de longitud de genes62 y analizando los genes regulados al alza y a la baja de forma independiente. Los términos GO con valores de p corregidos <0.05 se consideraron significativamente enriquecidos (Datos complementarios 2). Se siguió un enfoque similar para los análisis de enriquecimiento de la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG), mapeando números KO representados diferencialmente a su respectiva ruta KEGG (Datos complementarios 1).

En general, la ortología de genes se basó en la anotación funcional del repertorio de genes de O. fusiformis, basada en búsquedas BLAST en la base de datos SwissProt y búsquedas Panther (anotación funcional disponible en el repositorio https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Las secuencias de proteínas para ERK1/2 y ERK5, ligandos WNT, RHOX y homeoboxes relacionados, genes DLL y JAGGED, FOXH y FOXF y FGFR y VEGFR se recuperaron mediante la extracción de transcriptomas y bases de datos disponibles públicamente. Se construyeron múltiples alineaciones de proteínas (disponibles en Datos complementarios 1) con MAFFT v.7 en modo automático63 y las regiones mal alineadas se eliminaron con gBlocks versión 0.91b64. Los árboles de máxima verosimilitud se construyeron con RAxML v.8.2.1165 o FastTree66 y se visualizaron con FigTree (https://github.com/rambaut/figtree/). InterProScan 567 se utilizó para realizar la composición del dominio proteico de DLL.

Los genes candidatos (Tabla complementaria 6) y los marcadores genéticos utilizados para caracterizar los fenotipos del fármaco se amplificaron mediante dos rondas de PCR anidadas utilizando cebadores específicos de genes y un cebador universal T7 en ADNc de etapas de desarrollo mixtas como plantilla inicial. Las ribosondas se sintetizaron con la enzima T7 (kit MEGAscript de Ambion, #AM1334) y se almacenaron en tampón de hibridación a una concentración de 50 ng/μl a -20 °C. La hibridación in situ de montaje completo colorimétrica y fluorescente se realizó siguiendo un protocolo establecido3,30. Después de lavar la sonda, las muestras para la hibridación fluorescente in situ se incubaron con fragmentos Fab anti-DIG-POD (ROCHE, n.° 11633716001) y un anticuerpo anti-tubulina α acetilada de ratón (clon 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, n.° MABT868, 1:500) para co-teñir los límites celulares. Después del desarrollo de la señal con un kit Tyramide Signal Amplification (Akoya Biosciences, #NEL742001KT), estas muestras se lavaron varias veces en PTx y se trataron para la incubación de anticuerpos secundarios como se describe anteriormente. Para caracterizar la dinámica de la expresión génica in silico durante el desarrollo, utilizamos un conjunto de datos de RNA-seq disponible específico de la etapa33, que representa la expresión promedio de las dos réplicas con el paquete pheatmap v.1.0.12 disponible en R, donde la intensidad del color muestra el z- valor de puntuación para cada gen.

Utilizamos una combinación de seis marcadores morfológicos y seis moleculares para caracterizar los fenotipos obtenidos después de todos los tratamientos farmacológicos (Tabla complementaria 3). Brevemente, se utilizaron la inspección visual y las proyecciones z-stack de imágenes de escaneo confocal para evaluar la presencia de setas, intestino anterior y posterior, músculos (en el intestino anterior, quetoblastos y elevadores), órgano apical (con mechón apical de cilios) y neuronas de órganos apicales. . Para respaldar la presencia/ausencia de estas estructuras larvales, evaluamos la expresión de marcadores moleculares específicos del tipo de célula a través de hibridación colorimétrica in situ de montaje completo, a saber, six3/6 (ectodermo apical y esófago), gsc (ectodermo oral anterior), cdx (intestino posterior), GATA4/5/6 (intestino medio), twist (mesodermo) y sinaptotagmina-1 (neuronas). Definimos el fenotipo comprimido como una larva con una morfología y patrón molecular como un tipo salvaje pero con un eje apical-ventral aplanado. El fenotipo radial carece de estructuras y marcadores mesodérmicos y del intestino posterior, y exhibe una expresión radializada del marcador ectodérmico oral gsc, con un número reducido de neuronas de órganos apicales y de órganos apicales. El fenotipo "rechoncho" muestra simetría bilateral y todos los puntos de referencia morfológicos de una larva de control, pero la región posterior y el mesodermo están subdesarrollados. La Fig. 3d complementaria muestra representaciones esquemáticas de fenotipos de control, comprimidos y radiales y sus respectivos puntos de referencia morfológicos / moleculares.

Se tomaron imágenes de embriones y larvas representativos de los análisis colorimétricos con un microscopio epifluorescente vertical Leica DMRA2 equipado con una cámara Infinity5 (Lumenera), usando óptica de contraste de interferencia diferencial y campo brillante. Las muestras teñidas con fluorescencia se escanearon con un Leica SP5 LSCM. Las pilas confocales se analizaron con Fiji y el brillo/contraste y el balance de color se ajustaron en Pixelmator Pro (v. 2.0.3) o Photoshop (Adobe), aplicando cambios siempre a toda la imagen y no a partes de ella. Las figuras finales fueron diseñadas utilizando Illustrator (Adobe).

Para identificar los motivos del factor de transcripción en las regiones accesibles a la cromatina alrededor de los loci cdx y delta, utilizamos dos ensayos replicados ya disponibles para la cromatina accesible a la transposasa utilizando bibliotecas de secuenciación (ATAC-seq)33 generadas a partir de >50 000 células de 850–900 coeloblastula a 5 hpf. Brevemente, las células se disociaron y lisaron en tampón de lisis ATAC enfriado con hielo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, IGEPAL al 0,1 % (v/v), Tween-20 al 0,1 % (v/v), Digitonina al 0,01 % (v/v)) con el uso suave de un mortero e incubado en hielo durante 3 min. Después de un lavado rápido con PBS enfriado con hielo y una nueva suspensión en tampón de lisis ATAC enfriado con hielo, la reacción de lisis se detuvo con tampón de lavado ATAC enfriado con hielo (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, 0,1% (v /v) Tween-20) y se mezcló invirtiendo suavemente el tubo tres veces. A continuación, los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación a 500 g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de ángulo fijo y se realizó la preparación de la librería y el etiquetado de la cromatina siguiendo el protocolo Omni-ATAC68. El mapeo de lectura y la llamada de picos se realizaron como se describe en otra parte33, y el enriquecimiento del motivo del factor de transcripción y la huella en las regiones accesibles a la cromatina se realizaron con HOMER v.4.1169 y TOBIAS v.0.12.070, respectivamente, utilizando pistas de picos reproducibles entre repeticiones (p < 0,05 ) disponible en Gene Expression Omnibus con número de acceso GSE184126 y un repositorio público (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Las pistas genómicas se trazaron con pyGenomeTracks v.2.171.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y sus archivos de información complementaria. Todos los datos de secuenciación de RNA-seq sin procesar generados en este estudio están disponibles en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso PRJEB47195. Además, este estudio utilizó el ensamblaje y la anotación del genoma de Owenia fusiformis, disponible en ENA con el registro GCA_903813345 y los picos de ATAC-seq disponibles en Gene Expression Omnibus con el número de registro GSE184126 y un repositorio público (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome ).

No se utilizó ningún código personalizado en este estudio.

Davidson, EH Mecanismos espaciales de regulación génica en embriones de metazoos. Desarrollo 113, 1–26 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lawrence, PA & Levine, M. Mosaico y desarrollo regulativo: dos caras de una moneda. actual Biol. 16, R236–R239 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Martin-Duran, JM, Passamaneck, YJ, Martindale, MQ & Hejnol, A. La base del desarrollo para la evolución recurrente de la deuterostomía y la protostomía. Nat. Ecol. Evol. 1, 5 (2016).

Artículo PubMed Google Académico

Gilbert, S. en Biología del Desarrollo (Sinauer Associates, 2000).

Davidson, EH Cómo funcionan los embriones: una visión comparativa de diversos modos de especificación del destino celular. Desarrollo 108, 365–389 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lemaire, P., Smith, WC & Nishida, H. Ascidias y la plasticidad del programa de desarrollo de cordados. actual Biol. 18, R620–R631 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schulze, J. & Schierenberg, E. Evolución del desarrollo embrionario en nematodos. Evodevo 2, 18 (2011).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Martin-Duran, JM & Marletaz, F. Desentrañando la escisión en espiral. Desarrollo https://doi.org/10.1242/dev.181081 (2020).

Henry, JQ Sistemas de modelos en espiral. Int J. Dev. Biol. 58, 389–401 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Lambert, JD Mesodermo en espiralianos: el organizador y la celda 4d. Exp. J. Zool. B mol. desarrollo Evol. 310, 15–23 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Henry, JJ Mecanismo conservado de determinación del eje dorsoventral en espirales de hendidura igual. Biol. del desarrollo. 248, 343–355 (2002).

Artículo CAS Google Académico

Freeman, G. & Lundelius, JW Implicaciones evolutivas del modo de especificación del cuadrante D en celomados con hendidura espiral. J. Evolut. Biol. 5, 205–247 (1992).

Artículo Google Académico

Van Den Biggelaar, JAM, Van Loon, AE & Damen, WGM La especificación de mesentoblastos y trocoblastos en especies con hendidura en espiral predice sus relaciones filéticas. Neth. J. Zool. 46, 8–21 (1995).

Artículo Google Académico

Dohle, W. Estrategias reproductivas y patrones de desarrollo en anélidos vol. 142 (Springer, 1999).

Kingsley, EP, Chan, XY, Duan, Y. & Lambert, JD Segregación generalizada de ARN en un embrión en espiral. Evol. desarrollo 9, 527–539 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lambert, JD & Nagy, LM Herencia asimétrica de ARNm localizados centrosómicamente durante escisiones embrionarias. Naturaleza 420, 682–686 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Render, J. Desarrollo de embriones obsoletos de Ilyanassa después de una distribución equitativa del material del lóbulo polar en la primera escisión. Biol. del desarrollo. 132, 241–250 (1989).

Artículo CAS Google Académico

Lavoie, H., Gagnon, J. & Therrien, M. Señalización ERK: un regulador maestro del comportamiento celular, la vida y el destino. Nat. Rev Mol. Biol celular. 21, 607–632 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Koop, D., Richards, GS, Wanninger, A., Gunter, HM y Degnan, BM El papel de la señalización de MAPK en el patrón y el establecimiento de la simetría axial en el gasterópodo Haliotis asinina. desarrollo Biol. 311, 200–212 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lambert, JD & Nagy, LM La cascada de MAPK en embriones espiralianos igualmente escindibles. desarrollo Biol. 263, 231–241 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Henry, JJ & Perry, KJ Activación de MAPK y la especificación del cuadrante D en el molusco gasterópodo, Crepidula fornicata. desarrollo Biol. 313, 181–195 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M. & Adoutte, A. El patrón de expresión de Brachyury en el molusco Patella vulgata sugiere un papel conservado en el establecimiento del eje AP en Bilateria. Desarrollo 129, 1411–1421 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kozin, VV, Babakhanova, RA & Kostiuchenko, RP Papel funcional para la señalización de MAP quinasa en el linaje celular y la especificación del eje dorso-ventral en el gasterópodo basal Testudinalia testudinalis (Patellogastropoda, Molluska). Ontogenez 44, 42–56 (2013).

CAS PubMed Google Académico

Lambert, JD & Nagy, LM Señalización MAPK por el organizador embrionario del cuadrante D del molusco Ilyanassa obsoleta. Desarrollo 128, 45–56 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lanza, AR & Seaver, EC La señalización de Activin/Nodal media la formación del eje dorsal-ventral antes de la formación del tercer cuarteto en embriones del anélido Chaetopterus pergamentaceus. Evodevo 11, 17 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pfeifer, K., Schaub, C., Domsch, K., Dorresteijn, A. y Wolfstetter, G. Herencia materna de torsión y análisis de la activación de MAPK en embriones del anélido poliqueto Platynereis dumerilii. PLoS One 9, e96702 (2014).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Amiel, AR, Henry, JQ y Seaver, EC Se requiere una actividad de organización para el patrón de la cabeza y la especificación del destino celular en el anélido poliqueto Capitella teleta: nuevos conocimientos sobre la señalización celular en Lophotrochozoa. desarrollo Biol. 379, 107–122 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kozin , VV , Filimonova , DA , Kupriashova , EE & Kostyuchenko , RP Patrón de mesodermo y morfogénesis en el poliqueto Alitta virens (Spiralia, Annelida): expresión de marcadores mesodérmicos Twist, Mox, Evx y papel funcional para la señalización de MAP quinasa. mecánico desarrollo 140, 1–11 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gonzales, EE, van der Zee, M., Dictus, WJ & van den Biggelaar, J. Brefeldin A y la monensina inhiben el organizador del cuadrante D en los anélidos poliquetos Arctonoe vittata y Serpula columbiana. Evol. desarrollo 9, 416–431 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carrillo-Baltodano, AM, Seudre, O., Guynes, K. & Martin-Duran, JM Embriogénesis temprana y organogénesis en el anélido Owenia fusiformis. Evodevo 12, 5 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weigert, A. et al. Iluminando la base del árbol anélido usando transcriptómica. mol. Biol. Evol. 31, 1391–1401 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rouse, G., Pleijel, F. y Tilic, E. Annelida. (Prensa de la Universidad de Oxford, 2022).

Liang, Y. et al. La genómica funcional de los anélidos revela el origen de los ciclos de vida bilaterales. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.02.05.479245 (2022).

Treadwell, AL La citogenia de Podarke obscura Verrill. J. Morph 17, 399–478 (1901).

Artículo Google Académico

Mead, AD El desarrollo temprano de los anélidos marinos. J. Morph 13, 227–326 (1897).

Artículo Google Académico

Woltereck, R. Contribuciones al análisis práctico del desarrollo de Polygordius según el 'Mar del Norte' y el 'tipo mediterráneo'. I. El período de desarrollo que es el mismo para ambos tipos: desde el huevo hasta la etapa más joven de Trochophora. Arch. f. desarrollo mech. 18, 377-403 (1904).

Artículo Google Académico

Newby, WW La embriología del gusano equiuroideo Urechis caupo. vol. 16 (Sociedad Filosófica Estadounidense, 1940).

Gonzales, EE, van der Zee, M., Dictus, WJ & van den Biggelaar, J. Brefeldin A o monensina inhibe el organizador 3D en moluscos gasterópodos, poliplacóforos y escafópodos. desarrollo Genes Evol. Rev. 217, 105–118 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Favata, MF et al. Identificación de un nuevo inhibidor de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno. J. Biol. química 273, 18623–18632 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sin capucha, PA et al. FoxH1 (Fast) funciona para especificar la racha primitiva anterior en el ratón. Genes Dev. 15, 1257–1271 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pogoda, HM, Solnica-Krezel, L., Driever, W. y Meyer, D. El factor de transcripción FoxH1/Fast1 de la horquilla del pez cebra es un modulador de la señalización nodal necesaria para la formación del organizador. actual Biol. 10, 1041–1049 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yamamoto, M. et al. El factor de transcripción FoxH1 (FAST) media la señalización nodal durante el patrón anteroposterior y la formación de nodos en el ratón. Genes Dev. 15, 1242–1256 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watanabe, M. & Whitman, M. FAST-1 es un efector materno clave de los inductores del mesodermo en el embrión temprano de Xenopus. Desarrollo 126, 5621–5634 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pruitt, MM, Letcher, EJ, Chou, HC, Bastin, BR y Schneider, SQ Expresión del complemento del gen wnt en un embrión de corte en espiral y una larva trocófora. Int J. Dev. Biol. 58, 563–573 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

MacLean, JA 2nd & Wilkinson, MF Los genes Rhox. Reproducción 140, 195–213 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Golde, TE, Koo, EH, Felsenstein, KM, Osborne, BA & Miele, L. Inhibidores y moduladores de gamma-secretasa. Biochim Biophys. Acta 1828, 2898–2907 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hubaud, A. & Pourquié, O. Dinámica de señalización en la segmentación de vertebrados. Nat. Rev Mol. Biol celular. 15, 709–721 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Andrikou, C. & Hejnol, A. La señalización de FGF actúa en diferentes niveles de desarrollo del mesodermo dentro de Spiralia. Desarrollo 148, dev196089 (2021).

Sol, L. et al. Diseño, síntesis y evaluaciones de 3-[(3- o 4-carboxietilpirrol-2-il)metilidenil]indolin-2-onas sustituidas como inhibidores de tirosina quinasas receptoras de VEGF, FGF y PDGF.J. Medicina. química 42, 5120–5130 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sjöqvist, M. & Andersson, ER Haz lo que digo, no lo que hago: control lateral del destino celular. desarrollo Biol. 447, 58–70 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Johnson, AB & Lambert, JD El gen Caudal ParaHox es necesario para el desarrollo del intestino posterior en el molusco Tritia (también conocido como Ilyanassa). desarrollo Biol. 470, 1–9 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lyons, DC, Perry, KJ, Lesoway, MP y Henry, JQ Patrón de división y mapa de destino del mesentoblasto, 4d, en el gasterópodo Crepidula: un sello distintivo del desarrollo espiral. Evodevo 3, 21 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ozpolat, BD, Handberg-Thorsager, M., Vervoort, M. & Balavoine, G. Análisis de linaje celular y ciclo celular del micrómero 4d utilizando imágenes en vivo en el anélido marino Platynereis dumerilii. Elife 6, e30463 (2017).

Gharbiah, M., Nakamoto, A., Johnson, AB, Lambert, JD y Nagy, LM Ilyanassa Señalización de Notch implicada en la señalización dinámica entre las tres capas germinales. Int J. Dev. Biol. 58, 551–562 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

van den Biggelaar, JAM Desarrollo de polaridad dorsoventral y determinación de mesentoblastos en Patella vulgata. J. Morphol. 154, 157–186 (1977).

Artículo PubMed Google Académico

McGregor, AP, Pechmann, M., Schwager, EE y Damen, WG Una red reguladora ancestral para el desarrollo posterior en artrópodos. común Integrar Biol. 2, 174–176 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, BL & Kimelman, D. Señalización Wnt y la evolución del desarrollo embrionario posterior. actual Biol. 19, R215–R219 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fritzenwanker, JH, Uhlinger, KR, Gerhart, J., Silva, E. & Lowe, CJ Desenredar el crecimiento posterior y la segmentación mediante el análisis de los mecanismos de elongación del eje en los hemicordados. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 8403–8408 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. y Usadel, B. Trimmomatic: un recortador flexible para datos de secuencia de Illumina. Bioinformática 30, 2114–2120 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bray, NL, Pimentel, H., Melsted, P. y Pachter, L. Cuantificación probabilística de RNA-seq casi óptima. Nat. Biotecnología. 34, 525–527 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada de cambio de pliegue y dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 550 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Young, MD, Wakefield, MJ, Smyth, GK y Oshlack, A. Análisis de ontología génica para RNA-seq: contabilidad del sesgo de selección. Genoma Biol. 11, R14 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Katoh, K., Rozewicki, J. & Yamada, KD Servicio en línea MAFFT: alineación de secuencias múltiples, selección de secuencias interactivas y visualización. Breve. Bioinform 20, 1160–1166 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Talavera, G. & Castresana, J. Mejora de las filogenias después de eliminar bloques divergentes y ambiguamente alineados de las alineaciones de secuencias de proteínas. sist. Biol. 56, 564–577 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stamatakis, A. RAxML versión 8: una herramienta para el análisis filogenético y el análisis posterior de grandes filogenias. Bioinformática 30, 1312–1313 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Price, MN, Dehal, PS & Arkin, AP FastTree 2: árboles de probabilidad máxima aproximada para alineaciones grandes. PLoS One 5, e9490 (2010).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Jones, P. et al. InterProScan 5: clasificación de funciones de proteínas a escala genómica. Bioinformática 30, 1236–1240 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corcés, MR et al. Un protocolo ATAC-seq mejorado reduce el fondo y permite el interrogatorio de tejidos congelados. Nat. Métodos 14, 959–962 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heinz, S. et al. Las combinaciones simples de factores de transcripción que determinan el linaje priman los elementos reguladores en cis necesarios para las identidades de macrófagos y células B. mol. Celda 38, 576–589 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bentsen, M. et al. La huella de ATAC-seq revela la cinética de la unión del factor de transcripción durante la activación del genoma cigótico. Nat. común 11, 4267 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

López-Delisle, L. et al. pyGenomeTracks: gráficos reproducibles para conjuntos de datos genómicos multivariados. Bioinformática 37, 422–423 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Agradecemos a Ferdinand Marlétaz, Daria Gavriouchkina, Bruno Vellutini y a todos los miembros del laboratorio Martín-Durán por su apoyo y valiosos comentarios sobre el manuscrito, así como a Sandra Álvarez-Carretero por su ayuda con los análisis de RNA-seq, al personal de Station Biologique de Roscoff por su ayuda con las colecciones y los suministros para animales, y al Oxford Genomics Center en el Wellcome Center for Human Genetics (financiado por la referencia de subvención Wellcome Trust 203141/Z/16/Z) por la generación y el procesamiento inicial de datos de secuenciación de ARN-seq. Este trabajo fue financiado por una subvención inicial del Consejo Europeo de Investigación (número de acción 801669) para JMM-D. y una beca Queen Mary, Universidad de Londres para OS

Estos autores contribuyeron por igual: Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano.

Facultad de Ciencias Biológicas y del Comportamiento. Universidad Queen Mary de Londres, Mile End Road, E1 4NS, Londres, Reino Unido

Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano, Yan Liang & José M. Martín-Durán

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SO, AMC-B. y JMM-D. concibió y diseñó el estudio. OS, AMC-B., YL y JMM-D. realizó todos los enfoques experimentales y analizó críticamente los datos. SO, AMC-B. y JMM-D. escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y comentaron el manuscrito.

Correspondence to José M. Martín-Durán.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Paschalis Kratsios y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Seudre, O., Carrillo-Baltodano, AM, Liang, Y. et al. ERK1/2 es una señal organizadora ancestral en hendidura en espiral. Nat Comun 13, 2286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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Recibido: 08 Agosto 2021

Aceptado: 11 de abril de 2022

Publicado: 28 abril 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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