Pérdidas inmunogenéticas co

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7610 (2022) Citar este artículo

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En los peces signátidos altamente derivados (peces pipa, dragones de mar y caballitos de mar), la evolución del comportamiento de crianza invertido en el rol sexual culminó en el embarazo masculino del linaje de los caballitos de mar, cuyos machos presentan una bolsa de cría especializada en la que las hembras depositan huevos durante el apareamiento. Luego, los huevos son envueltos íntimamente por un tejido similar a la placenta que facilita el intercambio de gases y nutrientes. Dado que los padres toleran inmunológicamente los embriones alogénicos, se sugirió que el embarazo masculino coevolucionó con adaptaciones inmunológicas específicas. De hecho, aquí mostramos que un reemplazo de aminoácido específico en el factor de transcripción tlx1 está asociado con la asplenia de los caballitos de mar (pérdida del bazo, un órgano central en el sistema inmunológico), según lo confirmado por un experimento CRISPR-Cas9 con pez cebra. La genómica comparativa a lo largo de la filogenia signátida reveló que la complejidad del repertorio de genes del sistema inmunológico disminuye a medida que aumenta la intensidad del cuidado de los padres. La evolución sincrónica de las alteraciones inmunogenéticas y el embarazo masculino respalda la noción de que el embarazo masculino coevolucionó con la tolerancia inmunológica del embrión.

La diversificación evolutiva de los animales fue de la mano de una creciente complejidad del sistema inmunitario1,2. Como sello distintivo de la evolución de los vertebrados, el sistema MHC/receptor de células B/receptor de células T, un brazo esencial del sistema inmunitario adaptativo, apareció por primera vez en los vertebrados con mandíbula y acompañó tanto a la radiación de los tiburones como a las rayas, y más tarde a la radiación de los peces óseos3,4. El surgimiento de células y moléculas especializadas, así como del sistema linfático y el bazo como un importante órgano linfoide secundario de los vertebrados, permitió una compleja reorganización inmunológica y modificaciones durante la evolución del sistema inmunitario adaptativo de los vertebrados2. Como rara excepción, el bazo está ausente en los caballitos de mar (Familia Syngnathidae)5,6. Esto plantea la cuestión de cómo se las arreglan sin este órgano inmunitario vital y qué seleccionó en última instancia para la pérdida evolutiva del bazo. Los caballitos de mar son famosos por su morfología icónica y su historia de vida muy inusual, que incluye un comportamiento melancólico invertido en los roles sexuales a través del "embarazo masculino"7,8. Mientras que las hembras en linajes más basales de signátidos simplemente pegan sus huevos a los parches de incubación en el lado ventral de los machos, la bolsa de incubación de los caballitos de mar de los machos representa un órgano más derivado para el cuidado paterno y es la estructura más compleja de su familia para proteger y nutrir embriones9 . Las hembras de los caballitos de mar transfieren los huevos durante el apareamiento a las bolsas de cría de los machos, donde se implantan los embriones y se nutren de una "pseudoplacenta". Su función es análoga a la placenta materna de los mamíferos y proporciona nutrientes y oxígeno a los embriones en desarrollo que eclosionan dentro de la bolsa de los machos10,11,12 (Fig. 1a).

a Un árbol de especies que muestra la evolución del embarazo masculino especializado y los rasgos de asplenia en el caballito de mar. Durante el embarazo, los embriones implantados en la "pseudoplacenta" de los caballitos de mar machos son reconocidos por el sistema inmunitario paterno. b Cuatro especies de caballitos de mar, de los principales linajes de caballitos de mar, se incluyeron en los análisis genómicos comparativos. Las especies recién secuenciadas se indican en rojo. Mamá, hace millones de años. c Las 30 principales vías KEGG de familias de genes contraídos en caballitos de mar. Las categorías involucradas en la inmunidad están coloreadas en marrón. Las figuras fueron creadas con BioRender.com. El mapa usado se descargó de un sitio web gratuito de mapas del mundo (https://www.freeworldmaps.net/outline/maps.html). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En los vertebrados, la viviparidad en las hembras, con la única excepción del embarazo masculino de los caballitos de mar con roles sexuales invertidos, ha evolucionado más de 150 veces de forma independiente13,14. Si bien el embarazo brinda ventajas a la descendencia en desarrollo, lo que les permite estar mejor protegidos de la depredación temprana y ser liberados en una etapa avanzada de la historia de vida, plantea un desafío inmunológico para la madre embarazada: ¿Cómo son inmunológicamente los embriones semialógenos? tolerado? Como solución a este desafío inmunológico, los embriones de mamíferos reducen la diversidad de moléculas MHCI expresadas en los trofoblastos, que constituyen la capa celular en contacto directo con el tejido materno4,15. Por el contrario, en los caballitos de mar, la coevolución del sistema inmunitario con el embarazo masculino sigue siendo en gran parte desconocida. Además del bazo, algunas otras partes importantes del repertorio genético del sistema inmunitario adaptativo están ausentes en los caballitos de mar, y se ha planteado la hipótesis de que estas pérdidas secundarias están relacionadas con la novedad evolutiva que es el embarazo masculino5,6.

En un esfuerzo por estudiar los cambios relacionados con el sistema inmunitario durante la evolución del embarazo masculino del caballito de mar, analizamos comparativamente los genomas de dos caballitos de mar secuenciados de novo junto con otros genomas de teleósteos que se habían publicado previamente, centrándonos en la innovación evolutiva de los sistemas inmunitarios relacionados. genes (Fig. 1b y Tabla complementaria 1). Descubrimos que una mutación de un solo aminoácido en el factor de transcripción tlx1 es probablemente la causa del cambio más drástico, la pérdida del bazo (denominada "asplenia") en los caballitos de mar. Esto lo verificamos mediante mutaciones knockout y missense de tlx1 en el pez cebra. Los nuevos conocimientos sobre el sistema inmunológico modificado, incluido el sistema del complemento y las inmunoglobulinas en este linaje, respaldan su vínculo previamente hipotético con el origen evolutivo del embarazo masculino.

Generamos genomas de referencia a nivel cromosómico de Hippocampus zosterae (2n = 44) y H. mohnikei que abarcan 458 Mb y 527 Mb, respectivamente. Con contig N50 de 7.3 Mb y 18.1 Mb y genes BUSCO casi completos (92.95% y 93.46%), logramos generar ensamblajes de alta calidad (Tabla complementaria 5, 6, Nota complementaria 1). Al incluir los genomas ya publicados de H. comes16 y H. erectus17, pudimos realizar análisis genómicos comparativos integrales de cuatro especies de caballitos de mar (subfamilia Syngnathinae) que evolucionaron al embarazo masculino (Fig. 1b) en comparación con otros nueve genomas de teleósteos de diferentes órdenes ( Nota complementaria 2). Mostramos que 1260 familias de genes han sufrido una contracción significativa en el linaje de los caballitos de mar (Figura complementaria 4a y Datos complementarios 1–2). El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de las familias de genes contraídos reveló firmas relacionadas con las vías de respuesta inmunitaria, como la enfermedad tiroidea autoinmune, el rechazo de aloinjertos y el procesamiento y presentación de antígenos (Fig. 1c y Tabla complementaria 13), que fue respaldado por un análisis de pérdida de genes (Fig. 4b complementaria y Datos complementarios 1). La contracción o pérdida de familias de genes relacionados con la inmunidad ha contribuido sustancialmente a las modificaciones identificadas en el sistema inmunológico del caballito de mar y presumiblemente están relacionadas con la evolución única del embarazo masculino y su estructura de bolsa de cría (Nota complementaria 3). Como a ninguno de estos genes se le puede asignar un papel en el desarrollo del bazo, su pérdida no puede ser la base molecular de la asplenia en los caballitos de mar.

Nuestro análisis genómico comparativo identificó genes sometidos a selección positiva, evolución rápida o que contenían mutaciones específicas de linaje en caballitos de mar (Datos complementarios 4–8). El desarrollo del bazo está mediado por la regulación precisa de varios factores de transcripción, incluidos Pbx1, Tlx1, Nkx3-2 y Nkx2-518,19,20 (Fig. 2a). En el dominio homeobox de tlx1 (inicialmente confundido con Hox1119,21) se identificó una mutación específica del caballito de mar (Fig. 2a y Figs. complementarias 8-10). Se ha informado que Tlx1, que contiene tres exones y un dominio homeobox (Fig. 2b), controla la especificación del destino celular de los primordios esplénicos y la expansión de órganos. Es el único gen conocido cuya pseudofuncionalización da como resultado la pérdida del bazo sin causar otras anomalías del desarrollo19. Para validar la especificidad de la mutación, ampliamos nuestros análisis a un rango filogenético más amplio (34 especies), incluidos mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces adicionales. Las secuencias de aminoácidos de la homeobox de tlx1 eran idénticas en todos los vertebrados excepto por una mutación específica del caballito de mar, donde una treonina hidrofílica (T, Thr) ha sido reemplazada por la alanina hidrofóbica (A, Ala) (Fig. 2b y Fig. 11a complementaria) ). La validación adicional de tlx1 exon2 en 18 especies de caballitos de mar confirmó que esta mutación es una característica común de todos los caballitos de mar (Fig. 2c, Figs. 12-13 complementarias y Nota complementaria 4). La familia Syngnathidae es un clado grande (>350 especies) y diverso de teleósteos morfológicamente únicos. Se pueden dividir en dos subfamilias: las Nerophinae y las Syngnathinae22,23. Al evaluar el locus de la mutación también en todos los demás miembros disponibles de la subfamilia Syngnathinae, detectamos que todos los miembros investigados del género Syngnathus (todos con órganos de crianza cerrados bastante derivados y estrechamente relacionados con los caballitos de mar8) comparten la mutación descrita. Por el contrario, miembros más lejanos con órganos de crianza menos complejos, como el dragón de mar y el pez pipa caimán, donde los huevos simplemente se adhieren al lado ventral de la cola de los machos8, han conservado la alanina ancestral en esta posición. En cuanto a la subfamilia Nerophinae, encontramos que las secuencias de TLX1 exhiben sustituciones de aminoácidos de A a L y de A a I en Oostethus manadensis y Nerophis ophidion, respectivamente (Fig. 11b complementaria). También proporcionamos el fenotipo esplénico para varias especies de signátidos utilizando métodos morfológicos, histológicos y Micro CT. Las disecciones mostraron que las especies de los géneros Hippocampus y Syngnathus (ambos pertenecientes a Syngnathinae) han perdido evolutivamente un bazo inequívoco, pero no Syngnathoides biaculeatus (pertenece a la subfamilia Syngnathinae) ni Nerophis ophidion (que pertenecen a la subfamilia Nerophinae) (Fig. 14 complementaria) ). Como las mutaciones en los exones de los genes que codifican proteínas pueden conducir a cambios fenotípicos sustanciales, planteamos la hipótesis de que la mutación identificada en el dominio homeobox conservado de tlx1 podría estar asociada con la pérdida del bazo en las especies Hippocampus y Syngnathus.

a Diagrama esquemático de los genes involucrados durante el crecimiento y la morfogénesis del bazo (modificado de estudios previos18). Color rojo Tlx1, la variación específica de secuencia en caballitos de mar; AR, ácido retinoico. b Estructura génica (panel superior) y múltiples alineaciones de aminoácidos (panel inferior) de Tlx1. Seahorse alberga una mutación sin sentido de A (alanina, Ala) a T (treonina, Thr) en el homeodominio. c Examen de datos ampliados de la mutación tlx1 identificada en 18 especies de caballitos de mar. Todos los caballitos de mar detectados exhiben T (ACT) en lugar de A (GCT o GCC o GCG), a diferencia de otros vertebrados. La figura fue creada con BioRender.com.

Para probar esta hipótesis, llevamos a cabo la edición del genoma mediada por CRISPR/Cas9 para generar dos linajes de pez cebra: la línea de eliminación completa del gen (tlx1▲) y la línea de mutación puntual específica (tlx1A208T) que imita la mutación sin sentido del caballito de mar (Fig. 3a, Suplementario Fig. 15 y Nota Complementaria 5). Como se muestra en las Fig. 3b y c, se encontró que tanto el pez cebra tlx1▲ como el tlx1A208T perdieron el bazo en todos los individuos examinados, lo que sugiere que la mutación específica del caballito de mar está causalmente relacionada con una alteración funcional de tlx1, lo que conduce a la asplenia funcional. Si esta mutación originalmente causó asplenia funcional en este linaje signátido, o si otra mutación fue causal, eliminó la selección estabilizadora de los genes involucrados en el desarrollo del bazo y tlx1 mutó solo entonces, no se puede resolver utilizando nuestro conjunto de datos. Estudios previos tanto en mamíferos como en peces cebra han demostrado que la inactivación de tlx1 produce asplenia congénita19,24, lo que indica una vía de desarrollo de vertebrados crucial y conservada. En un linaje de pez cebra adicional, se produjo otra mutación puntual de la A a la T en el sitio adyacente a la mutación específica del caballito de mar como mutación puntual de control. En consecuencia, la línea tlx1A207T tenía un bazo normal, similar al del pez cebra de tipo salvaje, lo que respalda aún más la hipótesis de que la mutación A208T en los caballitos de mar podría ser la causa de la pérdida del bazo (Fig. 3b, c y Figs. complementarias). 16–18).

una edición del genoma de tres líneas de pez cebra (tlx1▲, tlx1A208T y tlx1A207T) usando tecnología CRISPR/Cas9. Los procedimientos se detallan en la figura complementaria 15. ▲ representa la eliminación completa del gen, mientras que A208T y A207T indican las mutaciones puntuales específicas en los sitios 622 y 619 del pez cebra tlx1, respectivamente. Azul, tlx1▲; rojo, tlx1A208T; Amarillo, tlx1A207T. La secuencia de nucleótidos tlx1 del ADN genómico de tres líneas de pez cebra fue validada por secuenciación de Sanger. La figura fue creada con BioRender.com. b, c tlx1▲ y el pez cebra tlx1A208T exhibieron asplenia mientras que el pez cebra tlx1A207T tenía el bazo intacto; se calculó y enumeró la proporción de asplenia de los individuos (n = 11~23). El fenotipo esplénico de otros 74 individuos se enumeró en las Figs. complementarias. 16–18. Tipo salvaje WT. d Número de genes expresados diferencialmente (DEG) de tlx1▲ y tlx1A208T en comparación con los individuos de tipo salvaje a través de comparaciones de los transcriptomas de cerebro, riñón, intestino e hígado. e Mapa volcánico de los DEG compartidos y específicos del grupo en el cerebro de tlx1▲ y tlx1A208T en comparación con el del grupo de tipo salvaje. Azul, rojo y gris representan DEG significativamente cambiados en tlx1▲, tlx1A208T y ambos grupos, respectivamente. f GO enriquecimiento de los DEG entre tlx1▲ y tlx1A208T ilustran los diferentes patrones de expresión génica asociados con el desarrollo y la función del cerebro. El enriquecimiento se realizó con el paquete GOseq R y la P < 0,05 corregida indicó un enriquecimiento significativo. El tamaño del círculo representa el número de genes en cada categoría. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El factor de transcripción tlx1 contribuye no solo a la organogénesis del bazo, sino que también tiene un papel crucial en el desarrollo y la función del cerebro25. Los experimentos in situ de caballitos de mar tlx1 mostraron expresión en el cerebro posterior y los arcos faríngeos en embriones, similar a la de los ratones y el pez cebra durante la embriogénesis (Figura complementaria 19a y Nota complementaria 6) 19,21,24. Para investigar los efectos de los mutantes específicos de los caballitos de mar y compararlos con la línea completa de gen knockout, se realizaron análisis de expresión génica transcriptómica (RNAseq) del cerebro y tres órganos relacionados con el sistema inmunitario (hígado, riñón e intestino) (Nota complementaria 7). En comparación con la línea tlx1▲, la línea tlx1A208T siempre muestra patrones transcriptómicos más similares a los del tipo salvaje, con un número menor de genes expresados diferencialmente (DEG) en todos los tejidos analizados (Fig. 3d, Fig. 19b-e complementaria y Datos complementarios 11). En comparación con el pez cebra de tipo salvaje, el pez cebra asplenia (tlx1A208T) exhibió perfiles de expresión génica diferenciales de los genes involucrados en el MHC y las vías del complemento, p. riñón (Fig. 19i-k complementaria).

Además, la mayoría de los DEG fueron específicos para tlx1▲ o tlx1A208T, excepto por un pequeño número compartido por ambas líneas (75 genes, cerebro), lo que indica que la eliminación completa del gen causa efectos más graves en comparación con la mutación puntual (Fig. 3e, Fig. 19f-h complementaria y Datos complementarios 11). El análisis de enriquecimiento GO de DEG en el cerebro entre las líneas tlx1▲ y tlx1A208T reveló firmas en el componente de membrana, la actividad de la enzima oxidasa y los procesos biosintéticos (Fig. 3f, Fig. 20 complementaria y Datos complementarios 12), que son vitales para el desarrollo del cerebro y función26,27. Nuestros resultados sugieren que, aunque el pez cebra tlx1▲ y tlx1A208T tenían el mismo fenotipo de asplenia, la edición del genoma produjo efectos diferentes en otros órganos.

En un esfuerzo por probar la hipótesis de que la evolución regresiva del sistema inmunitario está vinculada a la evolución del embarazo masculino único, escaneamos genomas en busca de modificaciones en genes relacionados con el sistema inmunitario involucrados en el embarazo informados por publicaciones anteriores15,28,29,30,31 ,32 y registró su pérdida completa, número reducido de copias u otra variación de secuencia notable (Fig. 4a y Nota complementaria 8). En este estudio, observamos la presencia ubicua de moléculas MHCII (tres copias de MHC IIa y de tres a cuatro copias de MHC IIb) y una pérdida notoria no solo de cd8b6, sino también de batf3 en los caballitos de mar (Fig. 4a, Figs. complementarias 21a, 22). Mientras tanto, los genes il12a/b e ifng, que codifican las citoquinas que son importantes para la vía alternativa independiente de Batf333, están presentes en caballitos de mar y peces pipa (Fig. 4a).

a Números de copias de genes clave implicados en el desarrollo y la función de los linfocitos DC, MHC, T/B y los componentes 3–4 del complemento en los caballitos de mar y otros vertebrados. Célula dendrítica DC, complejo mayor de histocompatibilidad MHC. *, variación de la región ITAM (motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor); †, basado en secuencia parcial (secuenciación de baja cobertura y ensamblajes de genoma), pero con la variación de ITAM; #, número total de MHC II. Los tipos de bolsas de cría se muestran a la derecha. Las especies Hippocampus y Syngnathus exhiben las bolsas de cría cerradas. b Mapa esquemático que ilustra las compensaciones moleculares hipotéticas en el embarazo masculino de los caballitos de mar. La asplenia causada por la mutación tlx1 podría disminuir las poblaciones de células B CD5+. Además de la diversidad reducida correspondiente en los anticuerpos, la vía clásica del complemento desencadenada por las interacciones antígeno-anticuerpo también podría debilitarse, lo que afectaría los eventos posteriores que generalmente desencadenan el rechazo del aloinjerto. Se espera que la pérdida de C4 esté asociada con la disminución de la abundancia de células Treg, que organizan la tolerancia autoinmune. El icono sombreado y la línea punteada indican la pérdida de genes en los genomas de los caballitos de mar. Célula Treg, célula T reguladora. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

El bazo es esencial para la producción de linfocitos B-1a B, que son los responsables de la producción de anticuerpos naturales en los mamíferos34. Es importante destacar que también cd5, el gen homólogo al CD5 de mamíferos, que codifica la molécula de superficie de las células B B-1a, se perdió en los caballitos de mar (Fig. 4, Figs. complementarias 21b, 23). Además, encontramos que uno de los motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores (ITAM) necesarios en cd79a está ausente en los caballitos de mar (Fig. 4, Figs. complementarias 24-25). Como elemento vital del complejo receptor de células B, la variación estructural de cd79a podría cambiar la capacidad de señalización de los receptores de células B35. El sello distintivo del sistema inmunitario adaptativo de los vertebrados es la diversificación somática de la familia de las inmunoglobulinas (reordenamiento VDJ) como un avance del sistema inmunitario innato36. Aquí, encontramos un número significativamente reducido de dominios V en los genes codificadores de cadenas pesadas (ighv) en caballitos de mar y otros peces signátidos (solo 2 ~ 20) en comparación con otros teleósteos, incluidos tilapia, ornitorrinco, medaka, espinoso, fugu, pez cebra y gar manchado (≥35) (Fig. 4 y Fig. 26 complementaria). Además, los anticuerpos pueden inducir el rechazo de los no propios a través de la activación del sistema del complemento clásico, especialmente el componente del complemento 4d (C4d)37. En los mamíferos, varias complicaciones del embarazo se asocian con una activación excesiva o mal dirigida del sistema del complemento38. En este estudio, encontramos solo dos copias del gen C3 en los caballitos de mar, menos que en todos los demás teleósteos (de tres a ocho copias), mientras que C4 está completamente ausente (Fig. 4, Figs. complementarias 21c, 28a). Finalmente, en los mamíferos, la tolerancia inmunológica se ve reforzada por el aumento de las células Treg durante el embarazo39. Nuestro estudio reveló que foxp3, un regulador crucial en el establecimiento y mantenimiento de los fenotipos Treg40, también se perdió en los caballitos de mar (Fig. 4 y Fig. 28b complementaria). Además, varios genes vitales involucrados en el embarazo, incluidos cd8a, T-bet, C3, il12a, il12b y cd79a, también mostraron diferentes patrones de expresión durante el embarazo de los caballitos de mar, lo que indica aún más las características inmunitarias complejas y únicas del embarazo masculino (Fig. 29 complementaria). Además, un enfoque comparativo ampliado reveló que los caracteres de asplenia y embarazo masculino evolucionaron de forma independiente pero coincidieron en las mismas ramas (Hippocampus y Syngnathus) (Fig. 30 complementaria).

Los caballitos de mar poseen la forma más avanzada de embarazo masculino interno completo en comparación con otros signátidos y, al mismo tiempo, presentan asplenia. Un caballito de mar macho preñado enfrenta el dilema de defenderse inmunológicamente tanto a sí mismo como al embrión contra los patógenos prevalecientes, mientras que al mismo tiempo el embrión semialogénico debe ser inmunológicamente tolerado41. Los peces pipa y los caballitos de mar adaptaron su biología inmunitaria abarcando modificaciones y pérdidas de genes relacionados con el sistema inmunitario, por ejemplo, los genes de las vías CD8b y MHC II, lo que ilustra la notable flexibilidad del sistema inmunitario de los vertebrados en general6. Los machos preñados cambian aún más la expresión de genes inmunes como ptgs2, pla2g4a, chia y b2m6,42 lo que presumiblemente respalda la tolerancia inmunológica del embrión. Como parte vital del sistema inmunitario adaptativo, la falta de la vía del MHC de clase II aparentemente no siempre conduce a la asplenia, ya que los bazos están presentes en otras especies que perdieron el MHCII, como se sabe de Gadiformes (por ejemplo, el bacalao del Atlántico) y el rape no parasitante Lophius piscatorius43,44,45,46. Además, como importante órgano linfoide secundario que realiza principalmente funciones inmunológicas, la pérdida de un bazo, mediada por la inactivación de tlx1, está relacionada con una deficiencia inmunológica en ratones y peces cebra19,24,47. Nuestros resultados sugieren fuertemente que una mutación específica del caballito de mar en tlx1 conduce a la asplenia, como lo confirmaron los experimentos CRISPR-Cas9. Este hallazgo confirma que tlx1 es parte de una red de factores de transcripción no redundante requerida para el desarrollo del bazo y también da fe de la estabilidad evolutiva de las redes de factores de transcripción en la regulación del desarrollo de órganos entre teleósteos y mamíferos.

Las adaptaciones inmunológicas son clave en la evolución de estrategias de reproducción extraordinarias. El embarazo femenino evolucionó de manera convergente más de 100 veces en vertebrados y coevolucionó mediante el ajuste fino del sistema inmunológico. De manera similar, en los rapes de aguas profundas, la pérdida de partes de su sistema inmunológico permitió de manera crucial la integración del cuerpo masculino en el cuerpo femenino48. El embarazo masculino ha evolucionado a lo largo de un gradiente de creciente complejidad en el cuidado de los padres, que va desde la simple fijación del huevo al lado ventral de los machos (p. ej., Nerophina) hasta la complejidad observada en Syngnathus e Hippocampus que desarrollaron bolsas de cría con estructuras intrincadas similares a la placenta. La pérdida de las características inmunogenómicas identificadas en los peces signátidos surgió de manera concomitante con la evolución de una mayor complejidad en el cuidado de los padres, como se mostró anteriormente para la pérdida de MHC II y cd8b6. Combinado con la pérdida de batf3 identificada aquí, esto sugiere una modificación del procesamiento de antígenos y la inmunidad específica de antígeno en los caballitos de mar. Alternativamente, sin embargo, el embarazo masculino del caballito de mar también puede depender de la regulación alternativa de las células dendríticas a través de los genes batf, il12 e ifng, que están presentes en todos los signátidos, ya que es probable que cd8a compense la pérdida de su parálogo6. Coincidentemente, un estudio previo sobre la transcriptómica unicelular de células inmunitarias en Syngnathus typhle identificó una serie de componentes de la vía relacionados con MHC I y genes relacionados con citotóxicos, lo que respalda la presencia del subconjunto de células T CD8 + en pipefish49. El número reducido de copias de C3 y la pérdida de genes C4 en los caballitos de mar sugieren además una activación impedida del sistema del complemento, que puede reducir el reconocimiento y la inflamación del aloinjerto mediado por anticuerpos. En la misma línea, nuestros datos actuales se suman a la hipótesis de que la biología inmune de los signátidos podría evolucionar sincrónicamente con su embarazo masculino único16.

La responsabilidad principal de la tolerancia transitoria de las células T específicas para los antígenos paternos durante el embarazo se asignó a las células T reguladoras (Tregs), ya que aumentan la tolerancia inmunológica durante el embarazo39. La asplenia también podría estar relacionada directa o indirectamente con la pérdida de foxp3, ya que los pacientes con esplenectomía muestran una disminución de las células Treg FOXP3+ en sangre40, lo que implica un vínculo potencial entre el bazo y la abundancia de células Treg FOXP3+. Además, las diferencias inmunológicas dependientes del sexo afectan las respuestas inmunitarias a antígenos propios y extraños, y los números de Treg están asociados no solo con los niveles de esteroides sexuales sino también con el sexo50. La pérdida de foxp3 indica que los caballitos de mar parecen haber adoptado una estrategia evolutiva única para su inigualable inversión de roles sexuales, melancólico y nutritivo cuidado paterno. De hecho, como órgano conservado, la pérdida del bazo no solo puede ir acompañada de la evolución del embarazo masculino, sino que también puede provocar cambios en algunos otros rasgos, como los cambios observados en la respuesta inmunitaria (incluidos los genes perdidos/contraídos como batf3 , C4, C3, CD5 y foxp3). Por lo tanto, nuestra especulación de que la evolución sincronizada de la asplenia y el embarazo masculino puede no ser accidental, sino que existe un vínculo evolutivo. Además, como se demuestra aquí, esta reducción en el repertorio inmunitario se comparte en toda la familia Syngnathidae y no es exclusiva de los caballitos de mar; por lo tanto, serán necesarios más análisis para evaluar la estrategia de respuesta inmune en especies con diferentes niveles de complejidad de embarazo en el futuro.

Los caballitos de mar representan un solo linaje dentro de los Syngnathidae, una familia con más de 350 especies de las cuales muchas muestran formas menos derivadas de embarazo masculino, lo que podría enfrentar desafíos inmunológicos relacionados con el embarazo que los caballitos de mar aparentemente han superado. Además, gran parte de la diversidad de los signátidos sigue sin explorarse hasta la fecha y las variaciones en la complejidad morfológica y fisiológica de los órganos inmunitarios y de crianza solo se han descrito superficialmente9. La redundancia funcional en el sistema inmunitario dificulta la predicción de las consecuencias que la pérdida de genes podría tener en un organismo. Sin embargo, también es esta redundancia la que brinda la oportunidad evolutiva a los organismos de jugar con las vías reguladoras que organizan una respuesta inmunitaria eficaz mientras se adaptan a los desafíos fisiológicos, como el embarazo, lo que da como resultado una flexibilidad genómica inesperada de los sistemas inmunitarios de los vertebrados. Por ahora, nuestra comprensión de los intrincados desafíos inmunológicos que enfrentan los signátidos en las diferentes etapas del embarazo masculino aún es incompleta, nuestro estudio arroja luz sobre la base genética de una importante novedad inmunológica adaptativa supuestamente asociada con la evolución de la inversión de roles sexuales y el embarazo masculino en los caballitos de mar. . Teniendo en cuenta toda la filogenia signátida, todavía existe una profunda divergencia entre los linajes Hippocampus y Syngnathus23, y el fenotipo esplénico y la información de la secuencia del gen tlx1 de los linajes más estrechamente relacionados con Hippocampus, que faltan en nuestro estudio, mejorarían la resolución del conjunto de datos y así permitirnos formular conclusiones mejor informadas. Por lo tanto, alentamos a realizar más estudios que llenen estos vacíos en el conocimiento genómico.

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas y la aprobación de los respectivos Comités de Ética e Investigación Animal del Instituto de Oceanología del Mar del Sur de China, Academia de Ciencias de China.

En este estudio, se utilizaron dos individuos, un caballito de mar japonés macho adulto H. mohnikei y un caballito de mar enano macho adulto H. zosterae, para la secuenciación del genoma completo. H. mohnikei se recolectó de los mercados locales en Rizhao (Shandong, República Popular China) en 2017. H. zosterae fue donada por acuarios en Guangzhou a las Colecciones de Biodiversidad Marina del Mar de China Meridional, Academia de Ciencias de China en 2015 (Tabla complementaria 1). El ADN genómico se extrajo de cada muestra utilizando un protocolo estándar de fenol-cloroformo.

Se construyeron dos bibliotecas de extremos emparejados con un tamaño de inserción de 350 pb para caballitos de mar utilizando el sistema Illumina HiSeq 2500 (San Diego, EE. UU.). Las lecturas filtradas por calidad se utilizaron para la estimación del tamaño del genoma a través del método K-mer51. A continuación, se estimó el tamaño del genoma como sigue: Tamaño del genoma = Knum/Kprofundidad. También calculamos y graficamos la distribución de profundidad de 19 mer. Además, se realizó la secuenciación Nanopore para H. mohnikei. Brevemente, las bibliotecas se construyeron y secuenciaron en R9.4 FlowCells utilizando el secuenciador MinION (ONT, Reino Unido). Toda la secuenciación fue realizada por BioMarker Technologies Company (Beijing, China). La secuenciación PacBio se realizó para H. zosterae. El ADN genómico de la muestra se cortó a un tamaño promedio de 20 Kb utilizando un dispositivo g-TUBE (Covaris, Woburn, MA, EE. UU.). El ADN cortado se purificó y se repararon los extremos mediante enzimas de pulido, seguido de una reacción de ligadura de extremos romos y un tratamiento con exonucleasa para crear una plantilla SMRTbell de acuerdo con el protocolo de preparación de plantillas PacBio de 20 kb. Se usó un dispositivo BluePippin (Sage Science, Beverly, EE. UU.) para seleccionar el tamaño de la plantilla SMRTbell y enriquecer fragmentos grandes (> 10 Kbp). Luego se llevó a cabo la secuenciación de una sola molécula en una plataforma PacBio Sequel para generar datos de lectura larga.

También se utilizó una muestra de sangre del macho H. zosterae para la secuenciación Hi-C mediante la plataforma Illumina HiSeq 2500, utilizando lecturas de 150 pb de extremo emparejado. El ADN se aisló de la muestra y la cromatina fijada se digirió con la enzima de restricción DpnII durante la noche. Posteriormente, el ADN se cortó mediante sonicación hasta un tamaño medio de 350 pb. Las bibliotecas Hi-C se generaron utilizando enzimas NEBNext Ultra y adaptadores compatibles con Illumina. Los fragmentos que contenían biotina se aislaron utilizando perlas de estreptavidina. Todas las bibliotecas se cuantificaron mediante Qubit2.0 y el tamaño del inserto se verificó con un Agilent 2100. Luego, las bibliotecas se cuantificaron mediante qPCR. Los datos de Hi-C se mapearon a contigs basados en PacBio usando BWA (versión 0.7.10-r789; método de mapeo: aln). Se utilizaron datos mapeados de forma única para el andamiaje a nivel de cromosomas. HiC-Pro (versión 2.8.1)52 se usó para la eliminación de duplicados y los controles de calidad, y las lecturas restantes fueron pares de interacción válidos para un ensamblaje posterior.

Las sublecturas de PacBio se corrigieron y recortaron con Canu (versión 1.5, disponible en https://github.com/marbl/canu)53. wtdbg generó un borrador de ensamblaje con el comando 'wtdbg -i pbreads.fasta -t 40 -H -k 21 -S 1.02 -e 3 -o wtdbg' utilizando lecturas con corrección de errores de Canu. Se obtuvo una asamblea de consenso con el comando 'wtdbg-cns -t 40 -i wtdbg.ctg.lay -o wtdbg.ctg.lay.fa -k 15'. A continuación, las lecturas emparejadas de Illumina también se alinearon para el ensamblaje por consenso mediante BWA (versión 0.7.10-r789; método de mapeo: MEM) y el paso de pulido se realizó con el software Pilon (versión 1.22), con los siguientes parámetros: -- min depth 10 --cambios --threads 4 --fijar bases. El paso de pulido se repitió dos veces. Las estadísticas de ensamblaje se muestran en la Tabla complementaria 5. La evaluación comparativa de ortólogos de copia única universal (BUSCO) mostró que nuestro ensamblaje capturó el 93,46% y el 92,95% de los BUSCO completos de H. mohnikei y H. zosterae, respectivamente.

Usando contigs ensamblados a partir de los datos de PacBio, los datos de Hi-C se usaron para corregir uniones erróneas en contigs, ordenar y orientar contigs. El preensamblado se realizó para la corrección de contigs dividiendo los contigs en segmentos con una longitud promedio de 300 kb. Luego, los segmentos se preensamblaron con datos Hi-C. Los puntos mal ensamblados se definían y rompían cuando los segmentos divididos no se podían colocar en la posición original. Luego, los contigs corregidos se ensamblaron usando LACHESIS con parámetros CLUSTER_MIN_RE_SITES = 225, CLUSTER_MAX_LINK_DENSITY = 2, ORDER_MIN_N_RES_IN_TRUN = 105 y ORDER_MIN_N_RES_IN_SHREDS = 105 con pares válidos Hi-C. Los espacios entre contigs ordenados se llenaron con 100 'N's. Las matrices de interacción de secuencias se muestran en la Fig. 2 complementaria, y los resultados del análisis estadístico de los ensamblajes de cromosomas se resumen en la Tabla 6 complementaria.

La identificación de novo de repeticiones y elementos transponibles se realizó utilizando el PILER-DF54 y el RepeatScout55 con parámetros predeterminados. Se emplearon RepeatMasker y RepeatProteinMask (versión 3.3.0) para identificar elementos transponibles (TE) basados en búsquedas de homología en la biblioteca Repbase (versión 16.03) usando los parámetros "-nolow -no_is -norna -parallel 1" y "-noLowSimple –pvalue 1e-4". La predicción de genes ab initio se realizó utilizando tres programas, a saber, Augustus56, GlimmerHMM57 y SNAP58. El programa GeMoMa59 se ejecutó para la predicción basada en la homología al alinear el genoma ensamblado con O. latipes, S. salar, H. comes y H. erectus. A continuación, los datos del transcriptoma de H. erectus de nuestro trabajo anterior16 se descargaron y mapearon en el genoma, y TransDecoder (http://transdecoder.github.io) y GeneMarkS-T realizaron la predicción genética. PASA60 se utilizó para predecir las secuencias de Unigene sin ensamblaje de referencia en función de los datos del transcriptoma. Luego combinamos los resultados de estos tres métodos con EvidenceModeler61. Las funciones de los genes se anotaron aún más mediante la búsqueda en bases de datos disponibles públicamente, incluidas las bases de datos NR, KOG, KEGG, GO y TrEMBL.

Los conjuntos de datos de proteínas se obtuvieron de Ensembl-FTP release-96 [T. rubripes, G. aculeatus, O. latipes, O. niloticus, P. magnuspinnatus, D. rerio, X. maculatus y L. oculatus] u otras fuentes [G. morhua62, H. comes16, H erectus17, H. zosterae y H. mohnikei (presente estudio)]. Los ortólogos uno a uno se identificaron utilizando OrthoFinder versión 2.2.7 en la configuración predeterminada de las 13 especies de peces con aletas radiadas. Las secuencias de proteínas para estos ortólogos uno a uno se extrajeron luego en sus respectivos ortogrupos utilizando un script Perl interno. Se generaron múltiples alineaciones para cada uno de los ortogrupos usando MAFFT (versión 7.475). Las alineaciones de proteínas individuales se concatenaron juntas usando un script Perl interno. Se generó una alineación concatenada recortada utilizando Gblocks 0.91b con las 'posiciones de espacio permitidas' configuradas en "Con la mitad". ModelFinder63 se utilizó para deducir el modelo de sustitución más adecuado para la alineación recortada (modelo JTT + F + I + G4). Para el análisis de máxima verosimilitud, empleamos el modelo de sustitución de mejor ajuste según lo deducido por ModelFinder y 1000 réplicas utilizando el enfoque de aproximación de arranque ultrarrápido64 implementado en la versión 1.6.10 de IQ-TREE.

La expansión y contracción en familias de genes fueron calculadas por el programa CAFÉ (v 3.1) basado en el modelo de nacimiento y muerte65. Los parámetros "-p 0.01, -r 10000, -s" se establecieron para buscar el parámetro de nacimiento y muerte (λ) de genes basados en un procedimiento de remuestreo de Monte Carlo, y los parámetros de nacimiento y muerte en familias de genes con un valor P ≤ 0.01 han sido reportados. Las familias de genes sin homología en la base de datos SWISS-PROT se filtraron para reducir las posibles expansiones o contracciones de falsos positivos causadas por la predicción de genes. Los términos Go y KEGG de todas las proteínas utilizadas en el análisis comparativo se anotaron con ponche de huevo 5.066. La familia de genes con más del 90 % de sus miembros compartiendo las mismas anotaciones se consideró como la única familia funcional y su ponderación se fijó en 1. Para las familias de genes que contenían secuencias con múltiples anotaciones funcionales, se asignaron diferentes valores de ponderación a cada anotación funcional según a la razón de los tiempos anotados de cada término al total de tiempos anotados de todos los miembros. El valor de ponderación total fue de 1 para cada familia.

Cuando un gen no tiene homólogos dentro del clado de caballitos de mar, pero los homólogos de ese gen están presentes en el linaje hermano más cercano del clado de caballitos de mar, consideramos que el gen se perdió en los caballitos de mar67. Se extrajeron genes ortólogos uno a uno de cada especie y, en consecuencia, se generaron múltiples alineaciones de secuencias. El análisis de pérdida de genes se realizó utilizando un script interno en R.

Probamos PSG en los linajes de caballitos de mar en comparación con todas las demás especies de fondo. Los genes ortólogos se extrajeron de la misma especie seleccionada para el análisis de expansión/contracción de la familia de genes. Se generaron múltiples alineaciones de secuencia utilizando el software MUSCLE (v3.8.31). Los análisis de selección positiva se realizaron con el modelo de sucursal utilizando PAML68. Comparamos el modelo A (permite que los sitios estén bajo selección positiva; fix_omega = 0) con el modelo nulo A1 (los sitios pueden evolucionar neutralmente o bajo selección purificadora; fix_omega = 1 y omega = 1) a través de una prueba de razón de verosimilitud usando el programa Codeml en PAML . La importancia de los cocientes de probabilidad comparados se evaluó mediante pruebas de χ2 de PAML. Luego, se usó la función p.adjust incrustada en el lenguaje R para ajustar el valor P usando todos los valores p originales. Solo los genes con un valor de P corregido por FDR inferior a 0,05 se consideraron seleccionados positivamente.

En el análisis se utilizaron los mismos genes ortólogos y topología de árbol que los de las PSG. Se utilizó el modelo de rama en PAML, con el modelo de razón libre (modelo = 1) que permite que el valor varíe en cada rama. Los valores dN de todos los nodos y puntas de cada árbol se probaron usando la función t.test en la programación R y luego los valores p se ajustaron usando FDR. Los genes con un valor de P corregido por FDR inferior a 0,05 y el dN del linaje de caballitos de mar más alto que el del linaje hermano de caballitos de mar se consideraron como evolucionados rápidamente en el linaje de caballitos de mar. Luego se realizaron análisis de enriquecimiento GO y KEGG de REG.

Para identificar los LSG en los caballitos de mar, se utilizaron los mismos genes ortólogos y la topología de árbol producidos a partir de los análisis de PSG. Solo el estado ancestral de la especie de caballito de mar era diferente del de todas las demás especies de fondo. Los genes fueron reconocidos como los verdaderos LSG. Para garantizar la confiabilidad de los resultados, solo se usaron aminoácidos ancestrales con probabilidades posteriores ≥ 0,95 para determinar la mutación específica del linaje. Además, descartamos sitios mutados específicos de linaje dentro de fragmentos mal alineados: calculamos las similitudes de secuencia por pares de 10 aminoácidos que centran cada sitio mutado específico de linaje. Si la similitud media era inferior a 0,7 o la más baja inferior a 0,35, este fragmento se definió como un fragmento mal alineado69. Luego se realizaron análisis de enriquecimiento GO y KEGG de LSG.

Los genes sinténicos de otras especies (mosca de la fruta, anfioxo, humanos y pez cebra) se adquirieron mediante el navegador de genomas Ensembl de Genomicus (https://www.genomicus.biologie.ens.fr/genomicus-100.01). La salida se clasificó por contig/andamio/ligamiento genómico y luego por la posición de inicio dentro de cada uno de estos genes. A continuación, se realizó un análisis filogenético basado en las secuencias de aminoácidos Tlx1, Tlx2 y Tlx3 en vertebrados, incluido el caballito de mar alineado. Se incluyeron un total de 41 especies de ciclóstomos, peces (26 especies de 16 órdenes), anfibios, reptiles y mamíferos. Las secuencias de proteínas se alinearon usando MAFFT (versión 7.475) con ajustes manuales menores. Se generó un árbol de máxima verosimilitud con IQtree v.2. El soporte de Boot-strap se estableció a través de 1000 iteraciones para Ultra-Fast Bootstrapping y la prueba de relación de probabilidad aproximada similar a SH. El árbol de consenso fue visualizado por el software FigTree (versión 1.4.4).

A continuación, las secuencias de aminoácidos de Tlx1 de vertebrados representativos se compararon utilizando Clustal W 2.1. Los números de acceso de GenBank de estos genes se enumeran en la Tabla complementaria 16. Los resultados mostraron que las secuencias de aminoácidos del homeobox eran completamente idénticas entre todos los vertebrados, excepto por la mutación específica del caballito de mar en la que la treonina hidrofílica (T) reemplazó a la hidrofóbica. alanina (A) exclusivamente en el linaje del caballito de mar (Fig. 10a complementaria). A continuación, ampliamos manualmente los datos el alcance de la comparación a una selección de taxones más amplia, incluidos mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Se incluyeron un total de 38 vertebrados que contenían 23 especies de peces de 15 órdenes, y confirmamos que entre estas especies, solo los caballitos de mar albergaban la mutación específica del linaje (Figura complementaria 11a).

Se realizaron más análisis de PCR utilizando un total de 18 especies de caballitos de mar para validar esta mutación específica de linaje. Se extrajo ADN genómico de 18 especies de caballitos de mar, a saber, H. abdominalis, H. algiricus, H. barbouri, H. camelopardalis, H. capensis, H. comes, H. erectus, H. fuscus, H. hippocampus, H. histrix, H. ingens, H. jayakari, H. kelloggi, H. kuda, H. mohnikei, H. reidi, H. spinosissimus y H. zosterae. Los cebadores (F: 5′-TCTCACCGCTCACTGTAAC−3′; R: 5′-GGTCATTTTGAGGGCTTT−3′) fueron diseñados para amplificar el segundo exón de tlx1 en estos caballitos de mar. El procedimiento de PCR se llevó a cabo utilizando condiciones de PCR estándar. Los productos de la PCR se cargaron en un gel de agarosa al 1,5 % y se sometieron a electroforesis a 130 V durante 25 min. Los resultados fueron fotografiados bajo una luz ultravioleta. También investigamos el lugar geométrico de la mutación comparándolo con los genomas de todos los demás miembros disponibles de la subfamilia Syngnathinae, incluidos S. acus, S. typhle, S. scovelli, S. biaculeatus, P. taeniolatus, O. manadensis y Nerophis ophidion.

Para aclarar el fenotipo esplénico de los Syngnathidae, detectamos las muestras más disponibles (incluyendo H. abdominalis, H. erectus, S. typhle, S. biaculeatus y Nerophis ophidion). Brevemente, después de la eutanasia con 300 ng/ml de MS-222 (Sigma-Aldrich, EE. UU.), los individuos se diseccionaron y se tomaron imágenes con una cámara MVX10 (Olympus, Japón) o microscopios estereoscópicos Olympus SZX2 (Olympus, Japón). Además, la exploración Micro CT de S. biaculeatus se realizó en el Nemo Micro-CT (NMC-200) de PINGSENG Healthcare Inc, una tecnología de imágenes de alta resolución basada en el principio de CT de haz cónico. En primer lugar, las muestras se sumergieron en el agente de contraste durante 12 días y luego se colocaron en la cámara de muestra verticalmente, cuyo voltaje y corriente del tubo de exploración se establecieron en 90 kV y 90 uA, respectivamente. Durante el proceso de escaneo, el detector y la bombilla giraron 360° alrededor del eje central de la cámara de muestras y realizaron 10 000 proyecciones en el área de escaneo, que duraron 1000 s. Después de capturar imágenes con el detector, se reconstruyó de forma inversa utilizando el método FDK en el software Avatar (versión 1.7.2, PINGSENG Healthcare Inc.), con un tamaño de píxel de 10 um × 10 um × 16 um. Se realizaron análisis histológicos de los bazos de S. biaculeatus, luego también se tomaron muestras y secuenciaron los perfiles transcriptómicos de los bazos de S. biaculeatus y el órgano blanco pequeño de H. erectus (Datos complementarios 9).

El pez cebra de la cepa *AB (D. rerio) se mantuvo en un ciclo de 14 h de luz (8:00-22:00)/10 h de oscuridad (22:00-8:00) a 26–28 °C para inducir el desove. . Se usó mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 para generar indeles en pez cebra tlx1 (ENSDARG00000003965; http://ensembl.org) usando sitios identificados por ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/). Se indujo la mutagénesis dirigida a dos regiones en el exón 1 de tlx1, GGACCTGGACTACGGTTT (sitio 1) y GGTCCTACAACATGAACTT (sitio 2). Los ARNg purificados (~ 80 pg) se inyectaron conjuntamente con el ARNm de Cas9 (~ 400 pg) en embriones de pez cebra (pez F0) en la etapa de una célula. Dos días después de la inyección, se recolectaron de 8 a 10 embriones para la extracción de ADN genómico para verificar si el fragmento genómico objetivo estaba mutado. Las regiones genómicas diana se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en el vector pTZ57R/T. Los fundadores adultos se cruzaron con peces de tipo salvaje para obtener peces F1, que posteriormente se genotiparon y se cruzaron con peces de tipo salvaje para producir peces F2. A continuación, se entrecruzaron individuos F2 heterocigotos para producir peces F3 homocigotos. Finalmente, generamos dos líneas de pez cebra knockout tlx1. Se generaron dos alelos sin sentido tlx1 con deleción de 122 pb tlx1▲ (−122) y deleción de 5 pb tlx1▲ (−5) en el primer exón (las puntas de flecha rojas y la secuencia de reverso amarillo), lo que provocó mutaciones de cambio de marco en la posición 43 y 47 AA, respectivamente (la secuencia de respaldo rojo), así como un evento de terminación prematura de la transcripción en las posiciones 47 y 58 AA (la secuencia de respaldo verde) (Datos complementarios 10).

Se utilizó la recombinación homóloga (HR) mediada por CRISPR/Cas9 para generar mutaciones puntuales en el pez cebra tlx1. También usamos sitios identificados por ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) para diseñar objetivos CRISPR/Cas9 cerca de los sitios de mutación puntual. Los sitios diseñados se dirigieron a dos regiones en el exón 2 de tlx1, GGCGCGTGAACGACGTCCG (sitio 3) y GGAGGTGTTCGGTTCTGGTA (sitio 4). Los plásmidos donantes HR se construyeron utilizando el kit de clonación Hieff Clone Plus Multi One Step (YEASEN, China). El donante G622A HR se construyó ligando cuatro fragmentos (un brazo izquierdo, un brazo medio, un marcador selectivo y un brazo derecho) con el vector pHRHG (XinJia, China). Los fragmentos del brazo izquierdo (1081 pb), el brazo medio (923 pb) y el brazo derecho (950 pb) se amplificaron a partir del ADN genómico del pez cebra AB/WT utilizando la ADN polimerasa PrimeSTAR HS (Takara, Japón). La mutación puntual (G622A) en el brazo medio se introdujo mediante el sistema de mutagénesis rápida (Transgen, China). Para evitar que el sistema CRISPR/Cas9 extirpe al donante HR, también se introdujeron las mutaciones silenciosas de los dos sitios objetivo de CRISPR/Cas9 en el brazo medio mediante el sistema de mutagénesis rápida (Transgen). El marcador selectivo se amplificó a partir de un plásmido transgénico específico del corazón que incluye el promotor myl7, DsRed y la señal poliA de SV40. Además, se añadieron sitios frt a ambos lados del marcador selectivo, que podrían eliminarse mediante la escisión por la recombinasa Flp. El donante G619A HR se construyó de manera similar.

El plásmido donante G622A se purificó antes de la microinyección mediante el Gel Extraction Kit (Qiagen). La proteína zCas9, los sgRNA y el plásmido donante (15 pg) se inyectaron conjuntamente en embriones de pez cebra en la etapa de una célula. El pez cebra F0 adulto se cruzó con peces de tipo salvaje para detectar a los fundadores con expresión de marcador selectivo y genotipado correcto. Luego, los fundadores se cruzaron con peces de tipo salvaje para producir peces F2, en los que el marcador selectivo se escindió mediante inyección de ARNm de flp (50 pg) en la etapa de una célula. Posteriormente, los individuos F2 heterocigotos sin marcador selectivo se cruzaron para producir peces F3 homocigotos. Y también se obtuvo la línea G619A similar a la línea G622A. Los cebadores se enumeraron en Datos complementarios 10.

El pez cebra se sacrificó con 200 ng/ml de MS-222 (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se genotipificó mediante el recorte de la aleta caudal. El ADN genómico se extrajo de los tejidos de las aletas. Los genotipos de las tres líneas de mutación (tlx1▲, tlx1A208T y tlx1A207T) se determinaron utilizando condiciones de PCR estándar y luego se secuenciaron mediante secuenciación Sanger (Sangon Biotech Co., Ltd, China). Los cebadores fueron los siguientes: tlx1▲, F: 5'-ATCGTCTGTAGTTCCGTCTTTC-3', R: 5'-ACCGCTTTAACCGCTGAGA-3'; tlx1A208T y tlx1A207T, F: 5′-ATTTGCCTTCCACTGCTTGG-3′, R: 5′-CCAGCTGACCTCACGGTTTAT-3′.

Se extrajeron cuidadosamente montajes completos de órganos abdominales de acuerdo con un estudio previo de Xie et al.24. Brevemente, después de la eutanasia con 200 ng/ml de MS-222 (Sigma-Aldrich, EE. UU.), se extrajeron cuidadosamente los montajes completos de los órganos abdominales del pez cebra de tipo salvaje (23 peces), así como de tlx1▲ (11 peces), tlx1A208T (27 peces) y mutantes tlx1A207T (17 peces) (Fig. 3). A continuación, los órganos se fijaron en PFA al 4 % durante 5 min. Todos los peces cebra verificados se tomaron muestras al azar y se hicieron a ciegas con respecto al estado mutante. Se obtuvieron imágenes representativas con una cámara MVX10 (Olympus, Japón) (Fig. 3 y Figs. complementarias 16–18).

Se tomaron muestras de embriones de caballitos de mar alineados en diferentes etapas de desarrollo (etapa temprana (S1), ~6 días después de la fertilización, dpf; etapa media (S2), ~12 dpf; etapa tardía (S3), ~18 dpf) y se fijaron en paraformaldehído al 4 %. (PFA)/solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 °C, de acuerdo con los métodos de Leerberg et al.70. Los cebadores se diseñaron para la hibridación del gen tlx1 en caballitos de mar alineados (F: 5′-GATCACATGGGACTAGCGGCAC −3′; R: 5′- GGCGTAATACGACTCACTATAGGGGTGTTACAGTGAGCGGTGAGAGAG−3′). Las sondas antisentido de ARN se produjeron luego a través de la transcripción in vitro utilizando el kit de etiquetado de ARN DIG (SP6/T7) (Roche, Mannheim, Alemania). Durante la hibridación, los embriones de caballito de mar fueron digeridos con 10 µg/ml de solución de proteinasa K durante un tiempo adecuado y posteriormente fijados de nuevo en PFA al 4% durante 20 min. A continuación, los embriones se preincubaron en una solución de bloqueo de anticuerpos durante 1 hora a 20 °C con PBSTw y luego se incubaron durante 2 horas a 20 °C en una dilución 1:3000 de anti-DIG-AP Fab. Las muestras se lavaron dos veces durante 5 min cada una en PBSTw y se revelaron en solución de coloración (30 µl de stock de NBT/BCIP en 10 ml de tampón de coloración) a 4 °C. La reacción se terminó lavando con metanol al 50 % y al 100 % durante 5 min cada uno. A continuación, los embriones se fijaron con PFA al 4 % durante la noche en la oscuridad, se montaron en glicerol al 100 % y se tomaron imágenes con un microscopio estéreo Olympus SZX2 (Olympus, Japón).

Análisis transcriptómico del cerebro y tres órganos relacionados con el sistema inmunitario (el hígado, el riñón y el intestino) del pez cebra. Se construyeron bibliotecas de secuenciación de ARN de estos tejidos (cada tejido que incluye cuatro réplicas biológicas) de los peces cebra de tipo salvaje, tlx1▲ y tlx1A208T y luego se secuenciaron en una celda de flujo utilizando una plataforma Illumina HiSeq™ 2500 (Tabla complementaria 17). Los datos sin procesar (lecturas sin procesar) del formato FASTQ de estos cuatro tejidos se procesaron primero utilizando secuencias de comandos Perl internas. Las lecturas limpias se asignaron al ensamblaje del genoma del pez cebra (GRCz11) utilizando el programa TopHat2. Los niveles de expresión génica se estimaron con fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos (valores FPKM) utilizando el programa Cufflinks. Los genes de expresión diferencial (DEG) se verificaron utilizando DEGSeq2 y se identificaron en función de los valores p corregidos (valor Q) y las tasas de descubrimiento falso. Comparaciones por pares en 12 combinaciones (cerebro: tlx1▲ frente a WT, tlx1A208T frente a WT, tlx1▲ frente a tlx1A208T; riñón: tlx1▲ frente a WT, tlx1A208T frente a WT, tlx1▲ frente a tlx1A208T; hígado: tlx1 ▲ vs WT, tlx1A208T vs WT, tlx1▲ vs tlx1A208T, intestino: tlx1▲ vs WT, tlx1A208T vs WT, tlx1▲ vs tlx1A208T). Solo los genes con un valor absoluto de log2 (cambio de pliegue) ≥1 y una puntuación de significación de la tasa de descubrimiento falso <0,05 se utilizaron para el análisis posterior. El enriquecimiento de GO en cuatro combinaciones de tejido de tlx1▲ frente a tlx1A208T se llevó a cabo utilizando el paquete GOseq R y la P < 0,05 corregida indicó un enriquecimiento significativo.

Escaneamos los genomas en busca de un subconjunto de genes relacionados con el sistema inmunitario que podrían estar involucrados en el embarazo en cuatro especies de caballitos de mar, así como en otras seis especies de Syngnathidae, incluidos los peces pipa grandes, los peces pipa de nariz ancha, los peces aguja del golfo, los peces aguja cocodrilo, los dragones de mar maleza y los peces aguja Manado. . Las secuencias de proteínas de consulta de estos genes se obtuvieron de Ensembl Genome Browser 104 o NCBI con representantes de Homo sapiens, T. rubripes, O. latipes y G. aculeatus. En primer lugar, los genomas de las 10 especies de Syngnathidae se compararon con los de otros vertebrados utilizando la búsqueda de mejores resultados en TBLASTN v2.9.0 para encontrar lecturas coincidentes en nuestros conjuntos de datos genómicos. Los parámetros BLAST se establecieron en un límite esperado de 1E - 5, lo que permitió un número máximo de 1000 secuencias devueltas. Además, todos los genes relacionados con la inmunidad anteriores se predijeron utilizando la herramienta de predicción de genes basada en homología GeMoMa v1.7.159,71, con cuatro especies como organismos de referencia. Las especies seleccionadas fueron pez cebra, medaka, fugu y espinoso. Los intrones de las lecturas mapeadas de RNA-seq fueron extraídos y filtrados por los módulos GeMoMa ERE y DenoiseIntrons. A continuación, ejecutamos de forma independiente la canalización del módulo GeMoMa para cada especie de referencia utilizando MMseqs272 como herramientas de alineación, en los datos mapeados de RNA-seq. Finalmente, los once resultados de las anotaciones individuales se combinaron en una anotación final utilizando los módulos GeMoMa GAF y AnnotationFinalizer73. Además, para los genes de cadena pesada de inmunoglobulina (ighvs), el genoma del caballito de mar de cola de tigre se ha predicho completamente en Ensembl. Tomando la secuencia del caballito de mar de cola de tigre como referencia, usamos Exonerate (versión 2.2.0) para realizar una predicción de genes basada en homología para otros conjuntos de datos genómicos con los parámetros predeterminados. Se realizaron análisis filogenéticos de genes identificados en caballitos de mar y otros vertebrados representativos utilizando las secuencias de aminoácidos. Los números de acceso de GenBank de estas familias de genes utilizados para el análisis filogenético se enumeran en Datos complementarios 13.

Siete no-Syngnathiformes L. oculatus, D. rerio, T. rubripes, G. aculeatus, O. niloticus, O. latipes, X. maculatus y trece Syngnathiformes incluyendo H. comes, H. erectus, H. zosterae, H. mohnikei, S. acus, S. typhle, S. scovelli, P. taeniolatus, S. biaculeatus, O, manadensis, N. ophidion, F. commersonii y A. strigatus se utilizaron para realizar el análisis de reconstrucción de caracteres basado en estudios previos7 . Brevemente, la reconstrucción filogenética de estas especies se realizó con los métodos de la sección de análisis filogenético con modificaciones menores. Los datos empíricos disponibles sobre cuatro caracteres, incluido el reemplazo de aminoácidos en tlx1, el desarrollo de la bolsa de cría, la presencia de bazo y la simplificación de genes inmunes para cada especie incluida en los análisis filogenéticos, se mapearon en nuestra filogenia molecular en Mesquite Ver.3.70 (http://www. mesquiteproject.org/).

Los caballitos de mar forrados machos adultos no preñados (n = 4) y preñados (n = 4) recolectados de una piscifactoría (Zhangzhou, Fujian, China) fueron anestesiados con MS222 antes del muestreo de las bolsas de cría. Después de la separación de los embriones, la bolsa de cría se lavó con PBS para eliminar la contaminación embrionaria y se extrajo el ARN total utilizando el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó 1 µg de ARN total de la muestra de la bolsa de cría para sintetizar la primera cadena de ADNc usando ReverAce qPCR RT Master Mix con gDNA Remover (Toyobo, Osaka, Japón). Las reacciones "sin RT" se usaron como controles negativos. Los niveles de ARNm de los genes implicados en el embarazo, incluidos C3.2, cd8a, cd79a, gata3, il12a, il12b, T-bet y tgfb1, se determinaron mediante qRT-PCR (Fig. 27 complementaria). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 18. qRT-PCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real Roche Light-Cycler 480 (Roche, Mannheim, Alemania), utilizando el kit SYBR Green I (Toyobo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó β-actina como control interno.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Todos los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). Las diferencias estadísticas se estimaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados y el nivel de significación se fijó en 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las lecturas sin procesar del genoma completo y los ensamblajes de H. zosterae y H. mohnikei se han depositado en la base de datos del NCBI con el código de acceso PRJNA797939. Las lecturas sin procesar de RNA-seq (incluidos Danio rerio, S. biaculeatus y H. erectus) se han depositado en la base de datos del NCBI con el código de acceso PRJNA799842. Las accesiones de los genomas publicados anteriormente utilizados en este estudio se proporcionaron en los Datos complementarios 15. Además, los datos del fenotipo y la histología del bazo están disponibles en Figshare (https://figshare.com/projects/Immunogenetic_losses_co-occurred_with_seahorse_male_pregnancy_and_mutation_in_tlx1_accompanied_funcional_asplenia/153495). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts personalizados empleados para el análisis de los datos de secuenciación están disponibles en Figshare (https://figshare.com/projects/Immunogenetic_losses_co-occurred_with_seahorse_male_pregnancy_and_mutation_in_tlx1_accompanied_funcional_asplenia/153495).

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Los autores agradecen a las Colecciones de Biodiversidad Marina del Mar de China Meridional, CAS por proporcionar muestras; al Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Agrícola de Huazhong por proporcionar instalaciones experimentales y a la Agencia para la Ciencia, S. Fan y X. Lu por sus valiosos comentarios y sugerencias que mejoraron el manuscrito. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41890853 a SZ, 41825013 a QL, 42006108 a MQ), el Programa de Investigación Clave de Ciencias Fronterizas de CAS (ZDBS-LY-DQC004 a QL), Guangdong Basic y Applied Basic Research Foundation (2021A1515011380 a YL), el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizon de la Unión Europea (EC/H2020/755659 a OR), el Programa de investigación de prioridad estratégica de CAS (XDB42030204 a QL) y Key Proyecto de Despliegue de COMS de CAS (COMS2020Q14 a YZ).

Los siguientes autores contribuyeron por igual: Yali Liu, Meng Qu, Han Jiang y Ralf Schneider.

CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-Resources and Ecology, South China Sea Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, 510301, Guangzhou, China

Yali Liu, Meng Qu, Han Jiang, Geng Qin, Wei Luo, Haiyan Yu, Bo Zhang, Xin Wang, Yanhong Zhang, Huixian Zhang, Zhixin Zhang, Yongli Wu, Yingyi Zhang, Jianping Yin, Si Zhang y Qiang Lin

Laboratorio Provincial Clave de Biología Marina Aplicada de Guangdong, Instituto de Oceanología del Mar Meridional de China, Academia de Ciencias de China, Guangzhou, 510301, PR China

Yali Liu, Meng Qu, Geng Qin, Xin Wang, Yanhong Zhang, Huixian Zhang, Jianping Yin, Si Zhang y Qiang Lin

Universidad de la Academia China de Ciencias, 100101, Beijing, China

Yali Liu, Han Jiang, Yingyi Zhang y Qiang Lin

Ecología Evolutiva Marina, Instituto Zoológico, Universidad de Kiel, 24118, Kiel, Alemania

Ralf Schneider y Olivia Roth

Escuela de Graduados en Ciencias y Tecnologías Marinas, Universidad de Ciencias y Tecnologías Marinas de Tokio, Minato, Tokio, Japón

zhixin zhang

Instituto de Biología Molecular y Celular, A*STAR, 138673, Singapur, Singapur

Byrappa Venkatesh

Departamento de Biología, Universidad de Konstanz, 78464, Konstanz, Alemania

axel meyer

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

QL, AM, OR y BV concibieron el proyecto. QL y AM supervisó el estudio. XW y GQ recogieron las muestras. MQ, RS, HY, XW, YZ, HZ, ZZ y JY realizaron análisis genómicos. YL, HY y GQ realizaron análisis transcriptómicos. YL, WL, BZ y HJ realizaron análisis de edición genómica CRISPR/Cas9. YW y HJ realizaron la PCR cuantitativa en tiempo real. HJ y Yingyi Z. realizaron hibridación in situ. SZ realizó el análisis Micro-CT. YL, MQ, RS y QL escribieron el manuscrito con aportes de todos los demás autores. Todos los autores revisaron y contribuyeron al manuscrito final.

Correspondencia a Olivia Roth, Axel Meyer o Qiang Lin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Liu, Y., Qu, M., Jiang, H. et al. Las pérdidas inmunogenéticas coincidieron con el embarazo de machos de caballitos de mar y la mutación en tlx1 acompañó a la asplenia funcional. Nat Comun 13, 7610 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35338-7

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Recibido: 09 mayo 2022

Aceptado: 29 de noviembre de 2022

Publicado: 09 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35338-7

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