Lavados por aspiración de colonoscopia para el perfil metataxonómico de la mucosa de la espondiloartritis

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7015 (2023) Citar este artículo

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El estudio de la microbiota del tracto gastrointestinal de pacientes con espondiloartritis (SpA) se ha centrado en el análisis de muestras de heces, que representan principalmente la microbiota luminal. El objetivo de este estudio fue determinar la contribución del microbioma mucoso y luminal a la disbiosis intestinal en SpA, utilizando lavados por aspiración de colonoscopia (CAL), una alternativa reciente para los estudios regionales del tracto gastrointestinal. Analizamos 59 CAL (de colon sigmoide e íleon distal) y 41 muestras de heces, de 32 pacientes con SpA y 7 individuos sanos, utilizando perfiles metataxonómicos dirigidos al gen 16S rRNA. Se encontró una alta prevalencia de manifestaciones del tracto GI entre los pacientes con SpA (65,3%). Perfil metataxonómico, muestras CAL confirmadas del tracto GI inferior (colon o íleon) presentaron un bacterioma distintivo e indiferenciado y separado del que se encuentra en las muestras de heces o en el comienzo del tracto GI (cavidad oral (CO)). Las muestras del tracto gastrointestinal inferior y las heces de los pacientes con SpA exhibieron un comportamiento similar a la microbiota del grupo de EII con una riqueza y diversidad microbiana reducida, en comparación con los controles sanos. Curiosamente, se encontró un aumento en los taxones proinflamatorios en pacientes con SpA, como la familia Enterobacteriaceae (principalmente en el íleon), Succinivibrio spp. y Prevotella stercorea. Por el contrario, los pacientes con SpA presentaron una disminución significativa en los productores de SCFA Coprococcus catus y Eubacterium biforme. Nuestros datos respaldan el valor de las muestras de CAL para el estudio regional del tracto GI y contribuyen con información de posibles "taxones disruptores" involucrados en los trastornos asociados al tracto GI observados en pacientes con EspA.

Las alteraciones del microbioma (disbiosis) en el tracto gastrointestinal (GI) se han asociado con diferentes patologías con graves consecuencias sobre la salud y el bienestar. En algunos casos, estas alteraciones del microbioma pueden generarse como consecuencia de enfermedades sistémicas y degenerativas como las SpA, un grupo de trastornos reumáticos fuertemente relacionados con las manifestaciones extraintestinales y síntomas gastrointestinales1, siendo indiscutible cómo la incidencia de SpA está aumentando en pacientes con síndrome intestinal subclínico. inflamación2. Incluso los pacientes con SpA seronegativos y con síntomas gastrointestinales inespecíficos han presentado inflamaciones intestinales subclínicas definidas por hallazgos ileocolonoscópicos3.

También se ha reportado una relación de causalidad —asociada a la predisposición genética— en la que una disbiosis o la mera presencia de bacterias patógenas pueden desencadenar una respuesta inmune exacerbada promoviendo el desarrollo de varios trastornos autoinmunes como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), una manifestación estrechamente relacionado con SpA4,5. Numerosos estudios tuvieron como objetivo describir la composición de la microbiota intestinal y su papel en el desarrollo y la progresión de SpA6,7, sin embargo, la implicación de la disbiosis observada en el intestino de estos pacientes no se comprende bien8. A pesar de la controversia, la microbiota intestinal parece ser fundamental para el desarrollo de estas patologías.

El microbioma intestinal tiene una composición extremadamente variada con una diversidad bacteriana que oscila entre 500 y 1000 especies9. La implementación de tecnologías de secuenciación masiva basadas en PCR (es decir, secuenciación del gen 16S rRNA) ha permitido una comprensión más amplia de las comunidades microbianas y ha contribuido a la descripción del microbioma "saludable" o "no saludable". Para estudiar la composición microbiana intestinal, es posible utilizar diferentes tipos de muestras, como heces o biopsias del tracto gastrointestinal (GI). El más utilizado es la materia fecal debido a la facilidad y falta de riesgo durante la recolección10, sin embargo, la composición del microbioma varía según la ubicación en el tracto GI.

Las biopsias, la microdisección con captura láser, el cepillo luminal, entre otros, son alternativas para el estudio regional del tracto GI que ofrecen la descripción más precisa de la microbiota10. Sin embargo, si bien, cuando se requiere un procedimiento invasivo (es decir, colonoscopia), solo se solicita una biopsia (o microdisección con captura láser) en el caso de evidencia tisular anormal, lo que dificulta la obtención de un número adecuado de muestras en el contexto. de los estudios de SpA. Además de esto, las colonoscopias solo se prescriben a individuos no saludables, y considerando los riesgos y la complejidad de los procedimientos de colonoscopia, inscribir controles sanos siempre dificulta el desarrollo de estudios clínicos. Todas estas razones han llevado a los estudios de la microbiota intestinal al uso de las heces como indicador de la composición del microbioma intestinal, principalmente como una representación de la porción distal del tracto GI11. Pocos estudios incluyen localizaciones más proximales como el intestino delgado debido a la dificultad para llegar a esta porción, a pesar de ser uno de los trayectos más comprometidos en el contexto de SpA12.

En los últimos años se han propuesto métodos de muestreo no convencionales que ofrecen resultados similares a los encontrados en las biopsias, como el uso de residuos de CAL13. Aquí, evaluamos el uso de CAL del colon sigmoide y el íleon distal, la parte más proximal del intestino delgado, de ileonoscopias, y lo comparamos con muestras de heces, para estudiar el microbioma gastrointestinal en pacientes con SpA. Nuestros resultados metataxonómicos mostraron una composición similar de muestras CAL de íleon y colon, pero marcadas diferencias con las heces. Independientemente de la naturaleza de las muestras, los pacientes con SpA exhibieron una disbiosis significativa en diferentes regiones del tracto GI, con un marcado aumento de la abundancia de Enterobacteriaceae, que probablemente se originó en el íleon.

Treinta y dos pacientes con EsA, según la clasificación ASAS y los criterios del European Spondyloartropathy Study Group (ESSG)14,15, atendidos en el Hospital Militar Central y Clínicos IPS de Bogotá, Colombia, fueron incluidos en un estudio transversal aprobado por la institución Comité de Ética. Se incluyeron siete individuos voluntarios sanos como controles para la microbiota eubiótica. Además, se incluyeron tres pacientes diagnosticados con EII para ejemplificar la disbiosis en el tracto GI. Se incluyeron controles sanos de 18 a 65 años con estilos de vida, nivel socioeconómico y profesiones similares a los de los pacientes. Se les preguntó sobre la presencia de síntomas gastrointestinales (es decir, diarrea, heces con moco, hematoquecia, número de heces diarias, dolor y distensión abdominal) y dieta (Tabla complementaria S1); También se realizó examen clínico. Los criterios de exclusión fueron embarazo, lactancia, neoplasias malignas, otras enfermedades autoinflamatorias o autoinmunes, inmunodeficiencia, pancreatitis crónica o enfermedad hepática crónica y tratamiento con antibióticos en los últimos 3 meses. Ningún control reportó diarrea en las últimas 4 semanas, el 87,6% reportó una defecación por día, y el 14,3% restante reportó dos defecaciones. Se informó distensión abdominal ocasional para dos controles, y se informó intolerancia alimentaria menor en el 42,9%, en su mayoría debido a los productos lácteos (28,6%). Aun así, no había mucosidad ni sangre en sus heces, y su ileoscopia no mostró evidencia de alteraciones del tracto GI.

Se aplicó un cuestionario específico preguntando por síntomas gastrointestinales (Tabla Suplementaria S1), seguido de evaluación clínica por un reumatólogo y en pacientes con ≥ 2 síntomas gastrointestinales también se realizó evaluación clínica por un gastroenterólogo. Posteriormente se definió quiénes tenían indicación de ileocolonoscopia (con cromoendoscopia digital con magnificación en Clínica Gastroavanzada de Bogotá, Colombia) y análisis histológico. Después de la evaluación por gastroenterología y antes del procedimiento, se explicó a los pacientes los beneficios y riesgos de la ileocolonoscopia y se firmaron los consentimientos informados. Brevemente, se realizó una preparación de bajo volumen para colonoscopia con Travad Pik (Picosulfato de Sodio 10 mg + óxido de magnesio ligero 3,5 g + ácido cítrico 12 g), para lograr una adecuada limpieza de todos los trayectos colónicos e íleon distal, medidos con la escala de Boston (9/9)16.

Las colonoscopias se realizaron bajo sedación con propofol intravenoso asistido por anestesiólogo. Todos los procedimientos fueron desarrollados por un gastroenterólogo experto en endoscopia diagnóstica y terapéutica utilizando EVIS EXERA III CF-HQ190L/I (OLYMPUS) o ELUXEO® 700 Series EC-760ZP-V/L (FUJI). Después de la irrigación con SNS al 0,9% (~ 250 mL), se realizó aspiración de colon izquierdo e íleon distal con circuito cerrado estéril con bomba ERBE (EIP 2 irrigation pump flushes), y las muestras se recolectaron con trampa para pólipos ( eTrap® BX00711099: endoscopia ecográfica) (Fig. 1A–C). Se recogieron cinco mililitros de aspirados de colon (izquierda) e íleon distal en tubos Eppendorf separados. Los pacientes y las personas sanas también proporcionaron una muestra de heces recogida en un recipiente estéril. Tanto los aspirados (CAL) como las heces se mantuvieron a -80 °C antes del procesamiento posterior.

Residuos de lavado de colonoscopia como alternativa para el análisis de microbioma del tracto gastrointestinal (GI). (A) En la colonoscopia, los residuos de los lavados se recogen en una trampa de pólipos. Cuando la sonda llega al íleon o al colon, estas zonas se lavan y los residuos de la irrigación se recogen y se utilizan para el análisis del microbioma. El ADN total de muestras de lavados de íleon y colon, heces y cavidad oral (control de grupo externo) se extrajo y analizó mediante NGS dirigido al gen 16S. (B) Ampliación de las áreas de colon (izquierda) e íleon (derecha) tomadas mediante colonoscopia más cromoendoscopia digital de imágenes de banda estrecha de un paciente con SpA. En el colon sigmoide se muestran úlceras superficiales con pérdida del patrón vascular. En el íleon distal se observan áreas de atrofia con pérdida de vellosidades. (C) Análisis de coordenadas principales de disimilitud de Bray-Curtis (PCoA) basado en las características de la comunidad de bacterias. (D) y (E) Riqueza de la comunidad bacteriana. Variantes de secuencia de amplicón ASV, distancia filogenética de fe Faith-PD. (F) y (G) Diversidad de Shannon y uniformidad de Pielou, respectivamente. Se muestran valores p significativos (en cursiva) para la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.

Las muestras de colon e íleon (CAL) se centrifugaron durante cinco minutos a 10 000 rpm y el sedimento se usó para extraer el ADN total con el kit de purificación de ADN del microbioma PureLink™ (Thermo Fisher Scientific Inc.). El ADN de las heces se extrajo con el kit QIAamp PowerFecal Pro DNA (QIAGEN®). El ADN extraído se usó para preparar bibliotecas de amplicón del gen 16S rRNA. En resumen, un segmento que abarca las regiones variables V3 y V4 en el gen 16S rRNA se amplificó mediante PCR con Herculase II Fusion DNA Polymerase utilizando los cebadores 341F y 805R. Estos productos se usaron para crear bibliotecas Nextera XT Index Kit V2 y se secuenciaron con la plataforma Illumina MiSeq para obtener lecturas de extremos emparejados de 301 pb. Después de la secuenciación, la mediana del número de lecturas fue de 102 226 (rango de 56 803 a 207 845) y alcanzó la saturación en los gráficos de rarefacción.

Para procesar las bibliotecas generadas, se utilizó la canalización Qiime 2™17 de la siguiente manera. Inicialmente, al usar DADA2, los últimos 20 nt en el extremo 3' se recortaban debido a la baja calidad y las lecturas se limpiaban, unían, eliminaban el ruido y se agrupaban como variantes de secuencia de amplicón (ASV). Se encontraron 6042 funciones (ASV) en las bibliotecas con una frecuencia media de 41 881 (rango 9584–68 910). Las características se utilizaron para determinar la distancia filogenética (PD) de Shannon, Faith y Richards y los índices de uniformidad de Pielou, entre otros, para evaluar la riqueza, diversidad y abundancia relativa en los grupos de estudio. Por otro lado, los ASV se clasificaron y asignaron a niveles taxonómicos utilizando la base de datos de Greengenes (v. 13.5, actualizada el 01-05-2019)18. La clasificación taxonómica se validó con la base de datos SILVA 132_99 (actualizada el 13-12-2017). Para el análisis bioinformático, debido a las diferencias fisiológicas, incluimos como control externo los microbiomas de la cavidad oral de estos pacientes. Además, a pesar del pequeño número de muestras, para evidenciar la disbiosis, se incluyeron microbiomas de pacientes con EII, recolectados de CAL y heces para las comparaciones. Sin embargo, el análisis estadístico solo se realizó para muestras de EII de íleon y colon, donde obtenemos al menos tres muestras.

La similitud entre grupos se evaluó en QIIME2 mediante distancias Unifrac no ponderadas y análisis de coordenadas principales (PCoA) con índice de Bray-Curtis, con método PERMANOVA y computando 1000 permutaciones. Las diferencias estadísticas entre grupos para los índices de riqueza y diversidad se evaluaron usando ANOVA unidireccional ordinario y la prueba de comparaciones múltiples de Tukey en el software GraphPad Prism versión 9. En el análisis taxonómico de abundancia relativa, los taxones con abundancia diferencial significativa entre grupos se establecieron en STAMP19 usando la prueba de comparación múltiple de White. -prueba t paramétrica. Se asumieron como significativas las diferencias entre medias de proporciones promedio > 0,2% con un valor de p < 0,05.

Este estudio fue aprobado por el Comité Corporativo de Ética en Investigación del Hospital Militar Central. Todos los participantes firmaron un consentimiento informado para participar y fueron informados sobre el riesgo de los procedimientos. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

El grupo de individuos analizados en este estudio estaba formado por 32 pacientes con EspA y siete individuos sanos. De los pacientes con EsA, el 56,2% eran del sexo masculino y, en el momento del estudio, el 9,4% declaraba fumar, el 28,1% fumaba y el 15,6% se consideraba fumador pasivo. En cuanto al estado civil y económico, el 56,3% estaban casados (o vivían con el cónyuge), y la mayoría eran empleados (34,4%) o tenían pensión de jubilación (28,1%). El índice de masa corporal (IMC) mostró que el 56,3% presentaba sobrepeso y el 12,5% obesidad, el 31,2% restante presentaba IMC normal. En el grupo de controles sanos, el 85,7% eran mujeres, el 14,3% fumaban, el 42,9% habían fumado y el 28,6% eran fumadores pasivos. Según el estado civil, el 42,8% reportó vivir con el cónyuge, el 71,4% eran empleados, y en este grupo se observó un IMC normal en el 71,4% y el restante 28,6% tenía sobrepeso. En cuanto a los hábitos alimentarios, todos los controles informaron ser omnívoros, mientras que el 3,1% informó ser vegetariano estricto en el grupo SpA. Además, en este análisis también se incluyeron tres pacientes con EII (sin manifestaciones de SpA) para representar la microbiota disbiótica. La edad media de estos pacientes fue de 33,2 años (24-54), dos hombres y una mujer, todos eran pacientes con colitis ulcerosa tipo pancolitis con la clasificación de Montreal para colitis ulcerosa de E3S1. Dada la actividad leve y la extensión de la enfermedad, se encontraban en tratamiento farmacológico, con aminosalicilatos en el momento de la toma de muestras; la puntuación de actividad clínica MAYO estuvo entre 3 y 5, lo que indica actividad clínica leve, y la puntuación endoscópica MAYO para los 3 pacientes fue 1 con actividad endoscópica leve. Ningún paciente presentó complicaciones derivadas de la colitis ulcerosa o requirió cirugía20,21.

Centrándonos en las variables clínicas reumatológicas en el grupo de EsA, encontramos que el 71,9% de los pacientes estaban diagnosticados de Espondilitis Anquilosante (EA), el 21,9% de Artritis Psoriásica (APs) y el 6,3% de Artritis Reactiva (ReA). Siguiendo los criterios ASAS, el 9,4% de los pacientes se encontraron con afectación axial, el 25,0% con afectación periférica y el 65,6% presentaron síntomas axiales y periféricos simultáneamente. Se notificó infección previa al diagnóstico en el 9,4% de los casos. En cuanto a los síntomas musculoesqueléticos, se reportó la presencia de dolor lumbar inflamatorio en el 84,4%, mientras que el 15,6% refirió dolor lumbar mecánico, el 87,5% refirió entesitis y artritis, y el 18,8% dactilitis. Se informó tratamiento biológico en el 59,4% de los pacientes con EsA, con inhibidores de la IL-17 (9,4%) y anti-TNFα (50%); los casos restantes recibieron tratamiento convencional (40,6%). Reforzando el papel de las manifestaciones del tracto GI en SpA, el 65,3% de estos pacientes informaron más de dos síntomas gastrointestinales en el último mes.

Utilizando el CAL fue posible recolectar 29 y 30 muestras de íleon y colon, respectivamente; además, se incluyeron 41 muestras de heces y 29 de CO, esta última como control de grupo externo. El metaperfilado del gen 16S rRNA mostró, como se esperaba debido a las marcadas diferencias fisiológicas, que las muestras de OC se agruparon como un grupo distante del tracto GI inferior y las muestras de heces en Bray-Curtis PCoA (Fig. 1C). Aunque las muestras de heces y del tracto gastrointestinal inferior se agruparon más cerca, el íleon y el colon eran indistinguibles (regresión lineal múltiple para el análisis de varianza: p = 0,5691, R cuadrado = 0,8609), mientras que el grupo de heces se desplazó ligeramente hacia uno de los ejes y fue diferente del íleon y el colon. colon (valores p: 0,0051 y 0,0114, respectivamente). Dado que las heces arrastran microbios distribuidos por todo el tracto GI, esto puede explicar las diferencias en las heces. En consecuencia, las muestras de heces revelaron una riqueza de especies significativamente mayor, con una media de 212 ± 73 #ASV, frente a 142 ± 73 y 140 ± 69, para colon e íleon, respectivamente (Fig. 1D). La distancia filogenética de fe (índice de riqueza basado en el tamaño del árbol filogenético) confirmó una comunidad bacteriana de heces significativamente más rica, con 18,9 ± 5,4 para heces, frente a 10,6 ± 4,4 y 12,9 ± 4,3 (sustituciones/sitio), para colon e íleon, respectivamente ( Figura 1E). A pesar de tener una mayor riqueza de ASV (Fig. 1D), el bacterioma OC fue significativamente menos diverso, en comparación con colon e íleon (índice de Shannon: 4,9 ± 0,87, 4,8 ± 0,97 y 4,1 ± 1,1, para colon, íleon y OC, respectivamente) (Fig. .1F). En consecuencia, las muestras de heces fueron las más diversas (índice de Shannon: 5,9 ± 0,87). De acuerdo con eso, el grupo de heces fue el más parejo (parcialidad relativa de las especies), y nuevamente las muestras del tracto GI inferior exhibieron una distribución uniforme intermedia (Fig. 1G). En conclusión, las muestras CAL del tracto GI inferior (colon o íleon) presentaron un bacterioma distintivo e indiferenciado y diferente al que se encuentra en las muestras de heces o en el comienzo del tracto GI como OC.

Las características identificadas se evaluaron para la clasificación taxonómica, encontrando una firma de composición clara para las muestras del tracto gastrointestinal inferior de la mucosa (colon e íleon), compuestas principalmente por los géneros Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Eubacterium, Dorea y Clostridium (Fig. 2A). Aunque Bacteroides y Faecalibacterium también fueron abundantes en las heces, Prevotella mostró un marcado incremento en este grupo, y en general el bacterioma predominante (conformado por aquellos taxones con una frecuencia relativa > 0,5%) fue mayor, incluyendo 22 géneros, vs. 16 y 17 para colon e íleon, respectivamente. A nivel de familia, Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, Prevotellaceae, Fusobacteriaceae, Erysipelotrichaceae estuvieron presentes en el bacterioma predominante del tracto gastrointestinal inferior. A este nivel taxonómico, las muestras de heces mostraron en su bacterioma predominante: Succinivibrionaceae, Verrucomicrobiaceae y Bifidobacteriaceae, entre otras, que probablemente estén siendo transportadas desde lugares distantes del tracto GI inferior, o diferentes a la mucosa (bacterias circulantes luminales), debido a estas no se detectaron como predominantes en CAL de colon o íleon (Fig. 2B). La clasificación de orden mostró Clostridiales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Fusobacteriales, Erysipelotrichales como predominantes en el tracto GI distante (Fig. 2C). En general, la mayor diversidad y riqueza observada en las muestras de heces puede explicarse por un aumento en las familias y géneros taxonómicos, pero no en el orden y clase donde el número de taxones identificados como predominantes en los tres grupos fue similar (Fig. 2C,D). ).

Análisis taxonómico de muestras de colon, íleon y heces. El colon y el íleon exhiben una composición bacteriana más cercana. Las barras representan la frecuencia relativa promedio en diferentes niveles taxonómicos para cada grupo. Se muestran los niveles de género (A), familia (B), orden (C) y clase (D). Se muestran taxones con frecuencia relativa superior al 0,5%. Los taxones más abundantes se describen a la derecha de cada barra, comenzando en la parte superior con las características más abundantes.

El análisis de abundancia diferencial (usando diferencias entre medias, DBM), no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los bacteriomas de la mucosa del colon y del íleon, cuando se compararon a nivel de especie, género, familia, clase y phylum. Sin embargo, el orden de Burkholderiales fue más abundante en colon (proporción media para íleon y colon, respectivamente: 0,82 ± 1,07% y 1,54 ± 1,52%, p = 0,0499). Estos resultados confirman el bacterioma indistinguible identificado en colon o íleon mediante muestras CAL. Sin embargo, en comparación con las heces, las muestras del tracto gastrointestinal inferior mostraron un enriquecimiento de Dorea formicigenerans, Haemophilus parainfluenzae (solo significativo para el íleon), Clostridium paraputrificum y Methylobacterium mesophilicum (Fig. 3A). Las muestras de colon e íleon mostraron un enriquecimiento significativo de los géneros Bacteroides y Faecalibacterium; familias Enterobacteriaceae y Bacteroidaceae (Fig. 3C); y orden Enterobacteriales (Fig. 3D). Por otro lado, el análisis de abundancia diferencial confirmó el enriquecimiento y la mayor diversidad encontrada en las heces (Fig. 3A–D), la cual es impulsada en su mayoría por Bacteroidales (orden), y entre estos, Prevotellaceae (familia) y el género Prevotella, especialmente Prevotella copri. En resumen, las muestras de CAL del tracto GI inferior son útiles para el estudio de bacterias de la mucosa mediante estrategias dirigidas al gen 16S rRNA, con el agotamiento de un número importante de microorganismos que parecen ser arrastrados inespecíficamente por las heces, desde cualquier parte del sistema digestivo. .

El colon y el íleon presentan una composición característica de bacterias con algunos taxones sobrerrepresentados en estas regiones del tracto GI. La diferencia entre la abundancia relativa media (DBM, eje x superior), para el colon (verde) o el íleon (rojo) frente a las heces se representa con barras. Los valores positivos indican los taxones sobrerrepresentados en el colon o el íleon, y los negativos indican los sobrerrepresentados en las heces. Los asteriscos corresponden a los valores p (eje x inferior) para la prueba t no paramétrica de White. Los taxones que muestran DBM > 0,2 % y un valor de p < 0,05 para al menos una comparación pareada (íleon o colon frente a heces) se incluyeron en las gráficas. (A) Clasificación de especies. (B) Género. (C) Familia. (D) Orden, clase y phylum.

Se utilizaron bibliotecas de secuenciación dirigida del gen 16S rRNA de muestras de heces y CAL para establecer cualquier posible diferencia entre el bacterioma de pacientes con SpA y el de individuos sanos. La microbiota de muestras de heces de pacientes con SpA no mostró diferencias significativas en el número de ASV (252 ± 45 y 208 ± 73, SpA vs sanos, respectivamente) y Faith-PD (20,1 ± 4,1 y 19,0 ± 5,4, SpA vs sanos). , respectivamente) índices de riqueza, en comparación con los identificados en el grupo sano (fig. 4A). Además, la distribución uniforme de Pielou de la población de bacterias no mostró diferencias significativas entre sanos y SpA. No obstante, la diversidad de Shannon evaluada en este tipo de muestras fue significativamente menor en pacientes con EspA, con una media de 5,9 ± 0,43 frente a 6,4 ± 0,52 para individuos sanos (p = 0,0400).

Los individuos sanos exhibieron la mayor riqueza y diversidad de bacterias en diferentes áreas del tracto GI. Se muestran la riqueza (variantes de secuencia de amplicón, ASV), la diversidad de Shannon, la diversidad filogenética de Faith (PD) y la uniformidad de Pielou para las muestras de heces (A), colon (B) e íleon (C). Se muestran los valores p significativos (en negrita y cursiva) para la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Espondiloartritis SpA, enfermedad inflamatoria intestinal EII. Para las muestras de EII, el análisis estadístico solo se realizó para el íleon y el colon, donde obtenemos al menos tres muestras. Este grupo se incluyó para ejemplificar la disbiosis intestinal.

La microbiota residente en el colon mostró una disminución significativa en los índices de riqueza para los pacientes con SpA, tanto para el número medio de ASV (217 ± 26 vs. 132 ± 72, sanos y SpA, respectivamente) como para Faith-PD (15,6 ± 2,5 vs. 10,0 ± 4,1) (Figura 4B). Como se anticipó para los pacientes con EII, este grupo mostró una disminución significativa en la riqueza en comparación con los individuos sanos, pero sin diferencias con SpA. La diversidad de Shannon fue menor para los pacientes con SpA y EII en esta ubicación del tracto GI; sin embargo, las diferencias no fueron significativas, aunque no se puede descartar una posible tendencia a la disminución debido a los bajos valores de p (< 0,1). Se encontraron resultados similares en el íleon; nuevamente, la riqueza de bacterias y la diversidad de Shannon fueron menores para SpA (no significativa pero con valores de p bajos) y pacientes con EII, en comparación con individuos sanos (Fig. 4C). Estos resultados podrían explicarse por la insuficiencia en el poder estadístico debido a la pérdida de una muestra de íleon en el grupo sano.

Usando el DBM de las abundancias relativas (porcentaje en el grupo sano menos SpA) determinamos los taxones que mostraban alguna disparidad entre los grupos (Fig. 5). El orden Enterobacteriales, especialmente la familia Enterobacteriaceae, mostró un enriquecimiento constante en pacientes con SpA (Fig. 5C,D), tanto en ubicaciones del tracto GI bajo como en heces. Aunque hubo un aumento de la abundancia de alrededor de siete puntos porcentuales para estos taxones en las muestras de colon (mayor que el observado en las heces), no fue significativo (puntos verdes). Vale la pena señalar que el aumento significativo más alto de estos taxones se observó en pacientes con SpA en el íleon (−11,2 %, p = 0,0128). En conjunto, esto sugiere que el aumento aparente observado en las heces probablemente se deba a un enriquecimiento de la familia Enterobacteriaceae en el tracto gastrointestinal inferior de los pacientes con SpA, principalmente en el íleon.

Diferencias entre las abundancias relativas medias (DBM) (eje y) para el grupo de control (individuos sanos) frente a pacientes con SpA, para muestras de heces (naranja), íleon (rojo) y colon (verde). Los valores positivos de DBM indican aquellos taxones sobrerrepresentados en individuos sanos, y los negativos indican aquellos sobrerrepresentados en pacientes con SpA como Prevotella stercorea en el colon (A). En el eje x, se representan los valores p para las comparaciones pareadas de la prueba t no paramétrica de White (saludable frente a SpA). Los umbrales arbitrarios de DBM (± 0,2 %) y el umbral significativo del valor p (0,05) se muestran en líneas discontinuas azules horizontales y verticales, respectivamente. Se muestran taxones con abundancia diferencial significativa para las clasificaciones de especie (A), género (B), familia (C) y orden (D).

Los individuos sanos mostraron enriquecimiento de algunos taxones específicos en muestras de heces, como Erysipelotrichales (orden), Erysipelotrichaceae (familia), Eubacterium (género) y Eubacterium biforme (Fig. 5A-D), que no se vieron alterados en colon ni íleon, a pesar de de ser parte del microbioma abundante en estos lugares (ver Fig. 2). De igual forma, Aeromonadales (orden), Succinivibrionaceae (familia) y Succinivibrio (género), se enriquecieron en pacientes con EspA, específicamente en heces, pero no en colon o íleon, sin embargo estos taxones no se encontraron abundantemente en estas otras localidades. Tomando en conjunto estos resultados, se sugiere que estas alteraciones específicas de las heces probablemente sean provocadas por bacterias que residen en otros lugares diferentes al colon sigmoide o al íleon distal. Además, algunos otros taxones como Coprococcus (específicamente C. catus) y Prevotella stercorea (solo en muestras de colon) exhibieron reducción y enriquecimiento, respectivamente, en pacientes con SpA, con alteraciones leves pero significativas (Fig. 5A, B), que fueron solo perceptible en muestras CAL de colon o íleon. Estos taxones pertenecen al bacterioma abundante en muestras de heces, lo que probablemente dificulta esos sutiles cambios zona-específicos observados en colon y/o íleon. En conclusión, nuestros resultados muestran que, aunque la disbiosis asociada a SpA puede determinarse en cualquier tipo de muestras, utilizando CAL fue posible contribuir con evidencia de alteraciones del taxón bacteriano local en pacientes con SpA.

El uso de métodos alternativos de muestreo intestinal se está volviendo atractivo para el análisis más profundo de las composiciones bacterianas específicas de la región. Se ha informado que la fuente de nutrientes y la interacción con el huésped afectan la composición del bacterioma en el tracto GI, aumentando la abundancia y diversidad con la progresión hacia el intestino distal22. Es por eso que el uso de métodos de muestreo específicos de la zona es importante para comprender la dinámica entre el huésped y las bacterias residentes que promueve la patogénesis. Aunque las biopsias han sido reconocidas como el estándar de oro para los estudios regionales del tracto gastrointestinal de la mucosa, algunas limitaciones, como el bajo rendimiento de ADN (en algunos casos inadecuado para los estudios de NGS), la alta contaminación del ADN del huésped, el riesgo de sangrado e infección durante la recolección y la inadecuación para individuos sanos, aumentan la dificultad de los estudios del tracto gastrointestinal regional. Es por ello que aquí evaluamos el uso de CAL para el estudio de alteraciones del tracto gastrointestinal de la mucosa en pacientes con SpA. Se ha informado que CAL genera mayores rendimientos de ADN bacteriano, es aplicable a controles sanos y ofrece diferencias mínimas en comparación con las biopsias13,23. Nuestros resultados contribuyen al conocimiento del bacterioma de la mucosa del tracto gastrointestinal específico de la región, ya que hasta la fecha (revisado: 11-03-2023) pocos estudios se han centrado en el uso de muestras mucosas en lugar de fecales13,23,24,25, 26,27,28, y ninguno de ellos en el contexto de alteraciones del tracto GI asociadas a SpA.

Nuestros resultados de riqueza, diversidad y disimilitud (PCoA) demostraron que las muestras CAL de colon o íleon presentaban un bacterioma único e indistinguible, y diferente al que se encuentra en las muestras de heces o en el OC. Estos resultados señalaron dos conclusiones importantes: primero, la recolección de CAL es un buen método de muestreo para el estudio del microbioma de la mucosa (el representado por biopsias, microdisección por captura láser o CAL), ya que se observaron fuertes diferencias al comparar con muestras de heces que hacen una mejor representación. del bacterioma intestinal luminal; En segundo lugar, las muestras CAL no son las más apropiadas para la identificación de cambios a través de la progresión del tracto GI, debido a que se observaron variaciones mínimas al comparar los grupos de colon vs. íleon (sin diferencias en riqueza y diversidad y solo el orden Burkholderiales mostró enriquecimiento en colon). La indistinción del bacterioma del tracto GI inferior (íleon distal frente al colon sigmoide) y la diferencia con el bacterioma fecal se han demostrado antes para las biopsias (consideradas el estándar de oro)24,29. Vaga, et al. encontraron que la riqueza y diversidad de especies del metagenoma no mostró diferencias significativas en varias ubicaciones del tracto gastrointestinal de la mucosa (íleon terminal, colon transverso y recto) por medio de biopsias; y de manera similar, Zoetendal et al. no encontraron diferencias en el índice de similitud utilizando muestras de biopsia de mucosa distribuidas a lo largo del colon30. Una explicación razonable para estos resultados utilizando CAL o biopsias es que los cambios en la composición de la microbiota de la mucosa en diferentes lugares pueden verse obstaculizados por la contaminación del líquido luminal GI a través del canal endoscópico10. Como evidencia, los datos muestran que los grupos bacterianos más predominantes en el íleon eran anaerobios. Es bien conocido que la mayor parte de la población bacteriana predominante en el íleon son anaerobios facultativos, con una pequeña proporción de anaerobios31. No obstante, para tratar de reducir la contaminación, se lavó el ciego con NSS (100 mL), y después de aspirar el contenido, se volvió a lavar el canal con NSS (50 mL) antes de canular el íleon distal; una vez dentro del íleon distal se realizó una aspiración inicial de todo el contenido, el cual se descartó y se volvió a irrigar con SNS (~ 250 ml) y se aspiró el contenido con circuito cerrado estéril, y se recogieron las muestras con un pólipo trampa.

Sin embargo, nuestras muestras de CAL representaron con éxito el bacterioma de la mucosa, que es particularmente importante debido a su conocida interacción directa con las células epiteliales e inmunitarias23. De hecho, los pacientes con SpA mostraron una disminución en la riqueza bacteriana, y eso fue más evidente en el bacterioma de la mucosa (íleon y colon). Otros estudios han señalado diferencias más notables cuando se utilizan superficies mucosas en lugar de muestras fecales27. Desafortunadamente, el reclutamiento de individuos sanos que dieron su consentimiento para la recolección de muestras de colonoscopias (CAL) fue difícil, lo que redujo nuestro grupo de control, lo que afectó el poder estadístico para la diversidad bacteriana (índice de Shannon), aunque los pacientes con SpA mostraron una tendencia a la disminución de la diversidad (p < 0.1).

La pérdida de riqueza y diversidad se explicó por el enriquecimiento y el agotamiento de algunos taxones en los pacientes con EspA, lo que destaca su potencial como candidatos para futuros estudios. Entre ellos, la familia Enterobacteriaceae mostró un enriquecimiento constante en pacientes con EspA, tanto en las localizaciones del tracto GI de la mucosa baja como en las heces. El aumento significativo más alto para este taxón se observó en el íleon de los pacientes con SpA, lo que sugiere que el aumento de las heces probablemente se deba al enriquecimiento en el tracto gastrointestinal inferior de la mucosa, principalmente en el íleon, donde se produce la mayor parte de la inflamación intestinal en las regiones axial y periférica. Se produce SpA32. La familia Enterobacteriaceae ha sido previamente reportada como enriquecida en la microbiota fecal de la espondilitis anquilosante, el diagnóstico más representativo entre los pacientes con SpA33. Además, algunos géneros de Enterobacteriaceae como Yersinia spp., Salmonella spp. y Shigella spp. se han asociado a artritis reactiva34. Vale la pena señalar que Enterobacteriaceae ha demostrado ser un miembro decisivo de los consorcios microbianos, capaz de interactuar con la comunidad microbiana endógena para inducir colitis hereditaria materna y EII35, y la prevención del crecimiento de Enterobacteriaceae disminuyó el daño SI en modelos de colitis murina36. Sería interesante investigar más a fondo las Enterobacteriaceae para determinar miembros de esta familia relevantes en la interacción con el sistema inmunológico de nuestros pacientes, ya que se ha demostrado que una amplia gama de bacterias pertenecientes a esta familia es capaz de estimular las células de memoria reactiva Th1/17. , conocida por su actividad proinflamatoria (secreción de IFN-γ, IL-17A e IL-22)37, y que podría estar relacionada con manifestaciones del tracto GI o sistémicas en pacientes con EspA. Desafortunadamente, el poder de resolución de la tecnología de secuenciación utilizada en este estudio no permitió clasificar a los miembros de esta familia enriquecidos con SpA.

Curiosamente, encontramos un aumento fuerte y significativo de Succinivibrionaceae (y Succinivibrio spp), junto con un patrón no significativo de enriquecimiento de Akkermancia muciniphila y Bacteroides fragilis, en muestras de heces de pacientes con EspA (Fig. 5). Todos estos taxones han sido reportados como productores de succinato38. Sorprendentemente, la EII, la colitis y otras patologías asociadas con la disbiosis de la microbiota intestinal se han relacionado con la acumulación de succinato en la luz intestinal, que puede deberse al aumento de los productores de succinato y/o a la disminución de los consumidores de succinato39,40. Además, Saraiva, et al. el uso de ratones deficientes para el receptor de succinato Sucnr1/GPR91 atenuó el desarrollo de artritis y redujo el tráfico y la expansión de las células Th17 a los ganglios linfáticos y, por el contrario, la complementación con succinato mejoró el reclutamiento y el tráfico de Th17 y la gravedad de la artritis41. Estos hallazgos, y nuestros resultados de enriquecimiento de bacterias productoras de succinato en la luz de pacientes con SpA, sugieren que podrían tratarse con terapias dirigidas a la inflamación de succinato, como Clematichinenoside AR (C-AR), una medicina china tradicional natural42, o cualquier otra. estrategia dietética que reduce el succinato circulante. Otro taxón involucrado en la producción de succinato es Prevotella spp. que exacerba la inflamación de la mucosa intestinal, aumenta el succinato y reduce los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en el tracto GI43. Curiosamente, encontramos un enriquecimiento significativo de Prevotella stercorea en el colon sigmoide de pacientes colombianos con EspA.

Frente al aumento de productores de succinato, encontramos una disminución significativa de taxones relacionados con la salud, como Coprococcus catus y Eubacterium biforme en la microbiota de la mucosa (colon e íleon) y luminal (heces) de pacientes con EspA, respectivamente. Ambos taxones son ampliamente conocidos por su capacidad para producir metabolitos beneficiosos y por ser parte del microbioma intestinal saludable44,45. Producen butirato y Coprococcus catus también produce propionato (SCFA)46. En modelos animales, se ha demostrado que el propionato suplementado en la dieta (y algunos SCFA) reduce la gravedad de la artritis y la inflamación de las articulaciones47, y restaura la microbiota intestinal saludable48. De acuerdo con eso, la suplementación con butirato también afectó el desarrollo de la artritis al promover la producción del metabolito 5-HIAA (ácido 5-hidroxiindol-3-acético), por parte de actores secundarios en el microbioma intestinal y estimular un estado regulador inmunológico (aumento de las células Breg)49 .

En conclusión, el perfil metataxonómico confirmó que las muestras CAL del tracto GI inferior (colon sigmoide o íleon distal), en SpA presentaban un bacterioma distintivo con un comportamiento similar al grupo IBD, con una riqueza y diversidad microbiana reducida, en comparación con los controles sanos. En ese sentido, la restauración de una microbiota saludable y/o el control de la circulación de metabolitos en el tracto GI podría ser una estrategia para el tratamiento de pacientes con SpA, que podría complementar los tratamientos convencionales o biológicos para mejorar los síntomas o mejorar los resultados. Esta prueba de la disbiosis de los pacientes con SpA respalda aún más la importancia de la exploración de estrategias no convencionales, como las dietas ricas en fibra (que aumentan los SCFA), la suplementación con metabolitos o el desarrollo de metabolitos, o sus receptores, terapias dirigidas. Aquí, utilizando el perfil de microbiota específico de la región, contribuimos con información de posibles "taxones disruptores" involucrados en los trastornos asociados al tracto GI observados en pacientes con SpA, que podrían abordar el desarrollo de estas nuevas estrategias.

Las manifestaciones del tracto GI son muy prevalentes entre los pacientes con SpA. La interacción entre la microbiota intestinal y el sistema inmunitario puede explicar estas manifestaciones sistémicas y locales. Los estudios metataxonómicos actuales para esta enfermedad (y la mayoría de los estudios del tracto GI) se han centrado en el análisis del microbioma luminal, utilizando muestras de heces, pero las interacciones de señales ocurren en la mucosa. Aquí, implementamos muestras de CAL para representar el tracto gastrointestinal de la mucosa y compararlas con la microbiota luminal. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio de comunidades microbianas en pacientes con SpA que utilizan lavados de aspiración por colonoscopia. Nuestra estrategia permitió la inclusión de individuos sanos, lo que no es apropiado cuando se utilizan biopsias. Generamos evidencia importante de la disbiosis luminal y mucosa de SpA e identificamos algunos "taxones disruptores" previamente reportados como involucrados en la activación de estados inflamatorios, y asociados al enriquecimiento y agotamiento de algunos metabolitos importantes, que podrían abordar el desarrollo o implementación de nuevos Estrategias para el tratamiento de las EspA. Sin embargo, para fortalecer estas conclusiones, los estudios futuros deben abordar algunas limitaciones en nuestros resultados, como la pequeña cantidad de controles sanos y muestras disbióticas de EII.

Los conjuntos de datos generados para este estudio (lecturas sin procesar) se pueden encontrar en NCBI BioProject PRJNA847196 y en la Tabla S1.

espondiloartritis

Enfermedad inflamatoria intestinal

Tracto gastrointestinal

Lavados de aspiración de colonoscopia

Cavidad oral

Distancia filogenética de la fe

Análisis de coordenadas principales

Diferencias entre medias

Ácidos grasos de cadena corta

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We thank the institutions, laboratory personnel and researchers from Universidad El Bosque, Hospital Militar Central, Clinicos IPS and Fundación Instituto de Reumatología Fernando Chalem.

This study was supported by the Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación, (Grant No. 130877757442), Universidad El Bosque, Hospital Militar Central (2017–023 and 2019–032), Clinicos IPS, Gastroadvanced, Fundación de Reumatologia Fernando Chalem, Investigación y Biomedicina de Chihuahua and Asociación Colombiana de Reumatología (Grant- 2019). Funding for publication fees was provided by Asociación Colombiana de Reumatología and Universidad El Bosque.

Bacterial Molecular Genetics Laboratory/LGMB, Vicerrectoría de Investigaciones, Universidad El Bosque, Av. Cra 9 No. 131 A–02, Bogotá, Colombia

Ricaurte A. Marquez-Ortiz, Deisy Abril & Javier Escobar-Perez

Programa de Maestría en Ciencias Biomédicas Básicas, Facultad de Ciencias, Universidad El Bosque, Bogotá, Colombia

Moisés León

Grupo de Inmunología Celular y Molecular/INMUBO, Facultad de Odontología, Universidad El Bosque, Av. Cra 9 No. 131 A–02, Bogotá, Colombia

Cristian Florez-Sarmiento, Viviana Parra-Izquierdo & Consuelo Romero-Sanchez

Gastroavanzada, Bogotá, Colombia

Cristian Florez-Sarmiento & Viviana Parra-Izquierdo

Fundación Instituto de Reumatología Fernando Chalem, Bogotá, Colombia

Felipe Chalem

Hospital Militar Central, Departamento de Reumatología e Inmunología, Bogotá, Colombia

Consuelo Romero-Sanchez

Clinical Immunology Group, School of Medicine, Universidad Militar Nueva Granada, Bogotá, Colombia

Consuelo Romero-Sanchez

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Correspondence to Ricaurte A. Marquez-Ortiz or Consuelo Romero-Sanchez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Márquez-Ortiz, RA, León, M., Abril, D. et al. Lavados de aspiración de colonoscopia para el perfil metataxonómico de la mucosa de las alteraciones del tracto gastrointestinal asociadas a la espondiloartritis. Informe científico 13, 7015 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33597-y

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Recibido: 05 julio 2022

Aceptado: 15 de abril de 2023

Publicado: 28 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33597-y

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