Los agonistas de TLR5 mejoran los anti

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 31 (2023) Citar este artículo

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La resistencia primaria y adaptativa a las terapias de puntos de control inmunitarios (TIC) representan un obstáculo considerable para lograr una mejor supervivencia general. Los activadores inmunitarios innatos se han buscado activamente por su potencial antitumoral. Aquí informamos que un modelo murino de carcinoma mamario 4T1 singénico para cáncer de mama triple negativo altamente refractario establecido mostró una mayor supervivencia cuando se trató intratumoralmente con el agonista de TLR5 flagelina o CBLB502, un derivado de flagelina, en combinación con anticuerpos dirigidos a CTLA-4 y PD-1. Los ratones supervivientes a largo plazo mostraron memoria inmunológica tras la reexposición al tumor y un perfil distintivo de citocinas de activación inmunitaria que involucró tanto la inmunidad innata como la adaptativa. Los niveles séricos bajos de G-CSF y CXCL5 (así como los niveles altos de IL-15) fueron biomarcadores predictivos candidatos que se correlacionaron con una mayor supervivencia. También se observó un aumento de ICT inducido por CBLB502 en tumores de melanoma B16-F10 poco inmunogénicos. La terapia combinada de punto de control inmunitario más agonistas de TLR5 puede ofrecer una nueva estrategia terapéutica para tratar tumores sólidos refractarios a las TIC.

Las terapias de puntos de control inmunológico (TIC) han abierto nuevas vías terapéuticas contra el cáncer con efectos curativos duraderos1,2. Dos reguladores de puntos de control inmunitarios bien caracterizados que son objeto de las TIC son PD-1 y CTLA-43,4. PD-1 modula la actividad inmunitaria al inhibir la apoptosis de los T-regs inmunosupresores y promover la apoptosis de las células T específicas de antígeno5. También se sabe que PD-1 inhibe la activación de las células B6. Por el contrario, se cree que CTLA-4 interfiere con la activación de las células T4,5. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con cáncer no responden a estos tratamientos o recaen después de un período de respuesta7. Un tema común que prevalece en los mecanismos de resistencia es la imposibilidad de provocar una respuesta adaptativa duradera debido a deficiencias en cualquiera de una serie de pasos en el proceso de presentación del antígeno tumoral. Se cree que estas deficiencias probablemente son causadas por una baja expresión de proteínas antigénicas inherente o adquirida y/o el desacoplamiento de la señalización de presentación de antígenos en las células tumorales o el microambiente tumoral y la activación inmunitaria. Independientemente de los mecanismos de resistencia, es posible que la activación directa de la inmunidad innata pueda desencadenar una respuesta inmune capaz de superar la resistencia tumoral a las terapias basadas en puntos de control inmunitarios8.

La evidencia reciente indica que las terapias que aprovechan la inmunidad innata muestran un potencial antitumoral prometedor9. En varios estudios, Salmonella typhimurium, una bacteria intracelular facultativa flagelada, induce la regresión tumoral en modelos preclínicos10,11,12,13,14,15,16,17. Sobre la base de este concepto, se están realizando ensayos terapéuticos con especies de Salmonella (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03762291). Es probable que los efectos terapéuticos de Salmonella estén impulsados ​​por la antigenicidad de las bacterias y la activación del reconocimiento inmunitario del huésped de patrones moleculares asociados a patógenos por parte de los receptores tipo Toll (TLR)14,18,19,20. No es sorprendente que se haya demostrado que muchos agonistas de TLR provocan actividad antitumoral21,22,23,24. En particular, el tratamiento con flagelina bacteriana, un agonista de TLR525, produce respuestas antitumorales potentes en varios modelos de xenoinjertos para cáncer de colon, mama y próstata, así como en varios modelos de tumores espontáneos en ratones23,26,27,28,29,30, 31 Curiosamente, los niveles más altos de expresión de Tlr5 se correlacionan con una mayor supervivencia en pacientes con cáncer de mama, pulmón y ovario32. Aunque quedan por dilucidar los mecanismos precisos de los efectos antitumorales mediados por TLR5, se sabe que TLR5 media las respuestas inmunitarias innatas contra la flagelina bacteriana25, probablemente a través de la activación de vías proinflamatorias, incluido NF-κB26,32,33. De interés, TLR5 también puede mediar en la activación inmunitaria adaptativa al actuar como un receptor coestimulador en las células T CD4+ de una manera análoga al papel coestimulador de CD28 durante la activación de las células T CD4+ ingenuas34. Por lo tanto, es posible que las respuestas antitumorales sean un efecto colateral de la respuesta inmune del huésped a la flagelina. La respuesta inmunogénica mediada por TLR5 ha llevado a la exploración de reactivos derivados de flagelina adecuados para aplicaciones clínicas. CBLB502 (Entolimod) es un fragmento de proteína flagelina recombinante derivado de Salmonella enterica, que actúa como agonista de TLR5 y activador de la respuesta inflamatoria NF-κB35,36. En varios estudios preclínicos, el tratamiento con CBLB502 mostró efectos antitumorales y antimetastásicos mediante la activación de componentes del sistema inmunitario innato37,38,39,40,41. Se ha demostrado la administración sistémica segura de CBLB502 en roedores, primates no humanos y humanos35,42,43 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT01527136), un avance potencialmente significativo en comparación con el tratamiento con agonistas de otros miembros de la familia TLR en el contexto de la terapia del cáncer44,45,46 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT00960752). En este documento, exploramos combinaciones de agonistas de TLR5 y terapia de punto de control inmunitario (ICT) utilizando el modelo de tumor sólido de cáncer de mama inmunogénico 4T1 y el modelo de tumor de melanoma B16-F10 poco inmunogénico, ambos cánceres altamente agresivos y refractarios a las terapias estándar47,48,49. Cualquier demostración de sobrevivientes a largo plazo en estos modelos se consideraría un avance digno de más esfuerzos de traducción.

Para evaluar la activación de NF-κB mediada por flagelos y CBLB502 de células de carcinoma mamario 4T1, transfectamos de manera estable células 4T1 con un reportero transcripcional κB5:IκBɑ-FLuc compuesto por una región promotora κB5 concatenada, seguida por el gen reportero de fusión bioluminiscente IκBɑ-FLuc50 ,51. Este reportero proporciona una lectura de la degradación de IκBɑ inducida por ligando endógeno y la producción de nueva proteína de fusión IκBɑ-FLuc51, lo que produce una señal dinámica de dos fases. En el citoplasma, IκBɑ secuestra e inactiva los dímeros de NF-κB. La unión de flagelina (o CBLB502) a TLR5 en la superficie celular inicia la actividad de quinasa mediada por IKK y la subsiguiente fosforilación, ubiquitinación y orientación para la degradación proteasomal de IκBɑ endógeno, así como la proteína de fusión informadora32,51. Como era de esperar por este mecanismo, esto resultó en una reducción de la actividad bioluminiscente durante los primeros 100 min en cultivos tratados con flagelina (Fig. 1a, flecha roja) y los primeros 80 min en cultivos tratados con CBLB502 (Fig. 1b, flecha roja) . Posteriormente, los dímeros de NF-κB liberados se translocan al núcleo y se unen a la región promotora de κB5 del reportero, iniciando la transcripción y traducción de nuevas proteínas de fusión bioluminiscentes. Esto resultó en un aumento de la segunda fase en la señal bioluminiscente (Fig. 1a, b, flechas verdes), que después de un período de tiempo suficiente, volvió a un estado homeostático como se observó previamente con otros ligandos activadores de NF-κB32,52. En general, la incubación de células 4T1 con flagelina o CBLB502 dio como resultado una degradación dependiente de la concentración y una resíntesis posterior del indicador de fusión IκBα-FLuc que refleja el ciclo de señalización de NF-κB (Fig. 1a, b). La mitad de la concentración efectiva máxima (CE50) para flagelina y CBLB502 fue >104 ng/mL y 3,1 ng/mL, respectivamente, en esta línea celular, lo que demuestra directamente la potencia mejorada de CBLB502 para activar la vía de señalización de NF-κB (Fig. 1c, d).

Las células 4T1 que expresan pκB5:IκBαFLuc de manera estable se estimularon con el ligando indicado en t = 0 y se tomaron imágenes de la actividad bioluminiscente cada 5 min durante 4 h. Los datos se muestran como valores de flujo de fotones normalizados (promedio de pliegue inicial, pliegue de vehículo). Se trataron células 4T1 que expresaban pκB5:IκBαFLuc de forma estable con concentraciones crecientes de flagelina: 1 ng/ml (n = 7), 10 ng/ml (n = 2), 50 ng/ml (n = 2), 100 ng/ml ( n = 7), 500 ng/ml (n = 7), 750 ng/ml (n = 2), 1 μg/ml (n = 7), 2,5 μg/ml (n = 7), 3 μg/ml ( n = 5), 4 μg/ml (n = 5), 5 μg/ml (n = 7), 7,5 μg/ml (n = 5), 10 μg/ml (n = 7) y TNFα 20 ng/ ml (n = 7). Las barras de error representan SEM para el número indicado de experimentos independientes. b Las células 4T1 que expresan pκB5:IκBαFLuc de forma estable se trataron con concentraciones crecientes de CBLB502: 0,1 ng/ml (n = 3), 0,5 ng/ml (n = 3), 1 ng/ml (n = 3), 1,5 ng/ml (n = 3), 2,5 ng/ml (n = 3), 5 ng/ml (n = 3), 10 ng/ml (n = 3), 25 ng/ml (n = 3), 100 ng/ml (n = 3), 1 μg/ml (n = 3) y TNFα 20 ng/ml (n = 3). Las barras de error representan SEM para el número indicado de experimentos independientes. c La mitad de la concentración efectiva máxima (EC50) de flagelina en células 4T1 es >104 ng/mL en este modelo. d La mitad de la concentración efectiva máxima (CE50) de CBLB502 en células 4T1 es de aproximadamente 3,1 ng/mL en este modelo.

La activación de CBLB502 de la señalización proinflamatoria de NF-κB está mediada por TLR535, un conocido activador del sistema inmunitario innato25. Dado que CBLB502 es un potente activador de la señalización de NF-κB en células de carcinoma 4T1 (Fig. 1b, d), probamos si CBLB502 fue suficiente para provocar cambios estimulantes en el perfil de citoquinas de células 4T1. Medimos matrices de proteínas de 62 citocinas de ratón secretadas en medios acondicionados de células indicadoras 4T1 en respuesta al tratamiento nocturno con CBLB502 (1 µg/mL). La Fig. 1a complementaria identificó muchas citocinas reguladas al alza que activan la inmunidad innata (en orden de control de veces): SCF (97 veces), selección L (29 veces), CCL11 (7 veces), IL-3 y su receptor IL-3RB (4 y 7 veces respectivamente), CCL9 (7 veces), CCL20 (6 veces), (IL-12 p40/p70 (5 veces), CCL2 (5 veces), Leptin-R (4 veces), CCL3 (4 veces), IGFBP-5 (3 veces), CCL19 (3 ​​veces) y TNF-α (2 veces), mientras que algunos ejercen funciones reguladoras inmunitarias más amplias, como VEGF (3 veces), G-CSF (2 veces) e IL-2 (3 veces) (Tabla complementaria 1). CXCL13 (0,3 veces), CXCL12 (0,3 veces), IL-6 (0,3- veces), CD40 (0,4 veces) e IL-4 (0,6 veces) mostraron niveles reducidos (Fig. 1a complementaria y Tabla complementaria 1). Entre estas citocinas, CXCL1, CXCL5 y CCL2 mostraron un aumento detectable estadísticamente en comparación con el control del vehículo (dos colas, p ≤ 0,05) (Fig. 1b complementaria). Cabe destacar que se sabe que estas citoquinas son quimioatrayentes para componentes de la inmunidad innata como los neutrófilos y los monocitos53,54,55,56. En general, la incubación de CBLB502 (1 µg/mL) reprogramó el perfil de señalización de citoquinas celulares mediante la regulación al alza de muchas citoquinas reclutadoras de inmunidad innata y proinflamatorias.

A continuación, investigamos si la administración de flagelina o CBLB502 podría provocar respuestas antitumorales en un modelo de tumor 4T1 de cáncer de mama triple negativo singénico in vivo. Se generaron carcinomas de células mamarias en ratones BALB/c (de 5 a 6 semanas de edad) mediante inyección ortotópica de células tumorales 4T1 FUGW-FL en la cuarta almohadilla de grasa mamaria derecha. La progresión del tumor de cada ratón se evaluó semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) y mediciones de calibre del volumen del tumor (Fig. 2a-h complementaria). La señal bioluminiscente se detectó una semana después de la inyección ortotópica, lo que confirma la implantación exitosa del tumor. Los tumores eran palpables y mostraban una fuerte señal de bioluminiscencia dos semanas después de la inyección ortotópica, lo que indicaba un fuerte crecimiento del tumor. Luego, los ratones se aleatorizaron en cuatro controles de tratamiento diferentes: control de vehículo, ICT (anti-PD-1 y anti-CTLA-4), tratamiento con flagelina o CBLB502 y flagelina o CBLB502 en combinación con tratamiento con ICT en la dosis indicada (Tabla 1) y método de entrega (Tabla complementaria 2).

La supervivencia general combinada de cuatro experimentos independientes se muestra en la Fig. 2a. Todos los ratones bajo el control del vehículo (n = 25) o tratamiento solo con TIC (n = 23) murieron al final del estudio, lo que confirma el estado refractario a las TIC del modelo de cáncer de mama 4T1. Es de destacar que un ratón tratado con vehículo se identificó como un valor atípico utilizando el método ROUT por tener una medición de flujo de fotones baja en la semana 2 antes de que comenzara el tratamiento y se omitió del estudio. Se observaron ratones libres de tumores en el tratamiento con flagelina intratumoral solamente (dosis inicial de 10 µg/ratón) (n = 22) (un superviviente, p = 0,06, prueba de rango logarítmico) y en el tratamiento con flagelina intratumoral + ICT (n = 22) ( tres supervivientes, p = 0,001, prueba de rango logarítmico) (fig. 2a). Los ratones bajo el control del vehículo y los controles de tratamiento solo con flagelina mostraron una señal bioluminiscente constante con aumentos en los volúmenes tumorales (Figuras complementarias 2a, c). Curiosamente, los ratones tratados con ICT (solo ICT o ratones tratados con flagelina + ICT) mostraron una fuerte disminución en la señalización bioluminiscente una semana después del inicio del tratamiento (Fig. 2b, d complementaria, panel izquierdo); sin embargo, la disminución en la señalización bioluminiscente no estuvo acompañada por una disminución general en el volumen del tumor (Fig. 2b, d complementaria, panel derecho). Al menos dos posibilidades podrían explicar esta observación: muerte de células tumorales acompañada de un aumento del infiltrado inmunitario celular o pérdida selectiva o silenciamiento del casete bioluminiscente. Aunque no son mutuamente excluyentes, estos resultados en general apuntan a una remodelación inducida por las TIC en el microambiente tumoral con abundantes infiltrados de células inmunitarias, lo que no predice la supervivencia per se.

un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones BALB/c implantados con células indicadoras bioluminiscentes y fluorescentes 4T1 FUGW-FL ortotópicas en la semana 0 y tratados con flagelina con o sin ICT desde la semana 2 hasta la semana 4. Ratones tratados con control de vehículo (PBS) ( n = 25), se compararon TIC (n = 23), flagelina (n = 22) y tratamiento con flagelina + TIC (n = 22). El tratamiento con flagelina + tratamiento ICT tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la supervivencia (p = 0,0002, prueba de rango logarítmico; p = 0,003, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) en comparación con el tratamiento con control de vehículo. El tratamiento solo con ICT también mostró un efecto estadísticamente significativo sobre la supervivencia (p = 0,01, prueba de rango logarítmico; p = 0,03, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) en comparación con el tratamiento con control de vehículo. Sin embargo, todos los ratones tratados con ICT estaban muertos en la octava semana. El tratamiento solo con flagelina no mostró una diferencia detectable (p = 0,06, prueba de rango logarítmico; p = 0,08, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) en comparación con el tratamiento con control de vehículo. (b) El tratamiento combinado con CBLB502 (dosis baja) y ICT mejora la supervivencia. Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones BALB/c implantados con células tumorales informadoras fluorescentes y bioluminiscentes 4T1 FUGW-FL ortotópicas en la semana 0 y tratados con CBLB502 (dosis baja) con o sin ICT desde la semana 2 hasta la semana 4. Ratones tratados con vehículo de control (PBS) (n = 22), ICT (n = 25), CBLB502 (dosis baja) (n = 30) y CBLB502 (dosis baja) + ICT (n = 30) se compararon. El tratamiento CBLB502 (dosis baja) + ICT tuvo un efecto estadísticamente detectable sobre la supervivencia (p = 0,002, prueba de rango logarítmico; p = 0,001, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) en comparación con el tratamiento con control de vehículo. El tratamiento con TIC solo no mostró una diferencia estadística detectable mediante la prueba de rango logarítmico (p = 0,1), pero sí mostró una diferencia estadística detectable con la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon (p = 0,04). El tratamiento solo con CBLB502 (dosis baja) no mostró una diferencia estadística detectable (p = 0,8, prueba de rango logarítmico; p = 0,3 prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon). c Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones C57BL/6J implantados con células B16-F10 en el día 0 y tratados con CBLB502 con o sin ICT tres días después de la implantación del tumor. Se compararon ratones tratados con control de vehículo (PBS) (n = 20), ICT (n = 15), CBLB502 (n = 14) y tratamiento con CBLB502 + ICT (n = 39). El tratamiento con CBLB502 + ICT tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la supervivencia (p = 0,003, prueba de rango logarítmico; p = 0,01, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) en comparación con el tratamiento con control de vehículo. d Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones BALB/c Tlr5+/+ o Tlr5-/- implantados con células tumorales informadoras bioluminiscentes y fluorescentes 4T1 FUGW-FL ortotópicas en la semana 0 y tratados con control de vehículo (PBS) (n = 7, para cada cohorte de vehículos), ICT (n = 2 y n = 4 para ratones Tlr5+/+ y Tlr5-/- respectivamente), CBLB502 (n = 2 y n = 5 para ratones Tlr5+/+ y Tlr5-/- respectivamente) y CBLB502 Se compararon los tratamientos +TIC (n = 10, para cada cohorte CBLB502 + ICT). Los ratones Tlr5+/+ tratados con CBLB502 (dosis baja) + ICT tuvieron un efecto estadísticamente detectable sobre la supervivencia en comparación con los ratones Tlr5+/+ tratados con control de vehículo (p < 0,001, prueba de rango logarítmico; p < 0,01, Gehan-Breslow-Wilcoxon prueba) o ratones Tlr5-/- tratados con CBLB502 (it) + ICT (p < 0,001, prueba de rango logarítmico; p < 0,001, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon). Los ratones Tlr5+/+ tratados con vehículo de control mostraron una diferencia estadística detectable en la supervivencia en comparación con los ratones Tlr5-/- tratados con vehículo de control (p < 0,03, prueba de rango logarítmico; p < 0,03, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon).

Dado que CBLB502 mostró una mayor potencia y eficacia para la activación de la señalización de NF-κB que la flagelina (Fig. 1b, d) y que CBLB502 estimuló / reclutó citocinas activadoras de la inmunidad innata (Figura complementaria 1a, b y Tabla complementaria 1), probamos si el tratamiento intratumoral con CBLB502 (dosis baja) podría provocar una respuesta antitumoral más fuerte que el tratamiento intratumoral con flagelina. La supervivencia general combinada de cuatro experimentos independientes (Tabla complementaria 2) se muestra en la Fig. 2b. Un ratón del grupo de control del vehículo (n = 22) estaba inesperadamente libre de tumores al final del experimento. Este ratón mostró una señal bioluminiscente comparable durante las dos primeras semanas posteriores a la implantación del tumor, lo que indica que se implantaron suficientes células para el crecimiento del tumor (Fig. 2e complementaria, ratón 20). Sin embargo, cabe señalar que no se detectó ningún tumor palpable durante el transcurso del experimento, lo que hace probable que el ratón secuestrara las células tumorales antes de que el tumor pudiera establecer un crecimiento significativo. El tratamiento con CBLB502 solo (dosis baja) (n = 30) dio como resultado una señal bioluminiscente constante y un crecimiento tumoral sin sobrevivientes (Fig. 2g complementaria). El tratamiento ICT solo (n = 25) resultó en un ratón sin tumor (Fig. 2f complementaria, ratón 23) y un ratón que al principio pareció responder al tratamiento, pero luego desarrolló lentamente un tumor (Fig. 2f complementaria, ratón 18). ). De acuerdo con los resultados anteriores, los ratones tratados con ICT (solo ICT o CBLB502 (dosis baja) + tratamientos con ICT) mostraron una fuerte disminución en la señal bioluminiscente una semana después del inicio del tratamiento (Figura complementaria 2f, h), consistente con una pérdida inicial significativa de células tumorales 4T1. Lo que es más importante, el tratamiento con CBLB502 (dosis baja) + ICT dio como resultado un 20 % de ratones libres de tumores (n = 30) (p = 0,001, prueba de rango logarítmico; p = 0,001, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 2b) .

Probamos una dosis intratumoral de CBLB502 más alta (dosis alta de CBLB502), que es comparable a la dosis administrada a ratones en la cohorte de tratamiento con flagelina (Tabla 1). En tres experimentos independientes (Tabla complementaria 2), el tratamiento con CBLB502 (dosis alta) resultó en un ratón sin tumor en el tratamiento solo con CBLB502 (dosis alta) (n = 15) sin sobrevivientes en ninguno de los otros tratamientos (vehículo (n = 19), ICT (n = 17), CBLB502 (dosis alta) + ICT (n = 15)) (Fig. 3a-e complementaria). Curiosamente, un ratón adicional en el tratamiento solo con CBLB502 (dosis alta) mostró un retraso en el crecimiento del tumor (Fig. 3d complementaria, ratón 3). El sobreviviente solitario (Fig. 3d complementaria, ratón 5) mostró una diferencia estadísticamente detectable en la supervivencia de su control de vehículo (p = 0.01, prueba de rango logarítmico; p = 0.01, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon).

Exploramos más a fondo si la administración sistémica de CBLB502 (dosis baja) a través de inyecciones intraperitoneales (ip) podría provocar una respuesta similar a la administración intratumoral de CBLB502 (dosis baja). En dos experimentos independientes (Fig. 4a-e complementaria, Tabla complementaria 2), el tratamiento con CBLB502 (dosis baja) ip + ICT resultó en un 10 % de supervivientes a largo plazo (n = 20) (p = 0,01, prueba de rango logarítmico; p = 0.01, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 4e complementaria, ratones 1 y 5). Mientras que el control del vehículo (n = 8) y CBLB502 solo (dosis baja, administración ip, n = 20) no dieron como resultado sobrevivientes a largo plazo (Fig. 4b, d complementaria), los ratones tratados con ICT (n = 6) dieron como resultado uno sobreviviente a largo plazo en este experimento (p = 0.4 y prueba de rango logarítmico; p = 0.3 prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon, en comparación con el control del vehículo) (Fig. 4c complementaria, ratón 3).

Investigamos más a fondo si el tratamiento combinado de CBLB502 y ICT también podría provocar respuestas antitumorales en un tumor poco inmunogénico, como el modelo de tumor de melanoma B16-F10. Los tumores de melanoma se generaron en C57BL/6J (de 6 a 9 semanas de edad) mediante inyección subcutánea de células tumorales B16-F10 en el flanco dorsal derecho. Tres días después de la implantación del tumor, los ratones se aleatorizaron en cuatro controles de tratamiento diferentes: control de vehículo, ICT (anti-PD-1 y anti-CTLA-4), tratamiento con CBLB502 y CBLB502 en combinación con tratamiento con ICT en la dosis y el método de administración indicados. (Cuadro complementario 3). La supervivencia general de cuatro experimentos independientes se muestra en la Fig. 2c. La progresión del tumor para cada ratón se evaluó cada dos semanas utilizando mediciones de calibre del volumen del tumor (Fig. 5 complementaria). De cuatro experimentos independientes, un ratón de control del vehículo no desarrolló un tumor palpable durante la duración del experimento (Fig. 5a complementaria, ratón 18). Todos los ratones tratados solo con TIC (n = 15) murieron al final del estudio (Fig. 5b complementaria), lo que confirma el estado refractario a las TIC del modelo de tumor de melanoma B16-F10 sin la adición de una vacuna57. Solo un ratón en el tratamiento con CBLB502 (n = 14) no desarrolló un tumor al final del estudio (Fig. 5c complementaria, ratón 14). Sin embargo, las curvas de supervivencia no mostraron diferencias estadísticas detectables con el grupo de control del vehículo (p = 0,5, prueba de rango logarítmico; p = 0,3, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 2c). El tratamiento combinado con CBLB502 y ICT dio como resultado un 25 % de ratones libres de tumores (n = 39) en la semana 78 del estudio (p = 0,001, prueba de rango logarítmico; p = 0,003, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 2c y la figura complementaria 5d). Por lo tanto, el tratamiento combinado con agonistas de TLR5 y ICT mejoró la supervivencia in vivo de dos modelos independientes de tumores refractarios a ICT.

Probamos si los receptores del huésped TLR5 son necesarios para provocar la respuesta antitumoral observada en ratones tratados con CBLB505 en combinación con tratamientos ICT (Fig. 2d)). Los ratones Tlr5+/+ y Tlr5–/– se desafiaron con 4T1 FUGW-FL (Tlr5+/+) y se trataron como en experimentos anteriores (Tabla complementaria 4). La curva de supervivencia de Kaplan-Meier de dos experimentos independientes se muestra en la Fig. 2d. Todos los ratones bajo el control del vehículo murieron al final del estudio (Fig. 6a, e complementarias). Sin embargo, cabe señalar que la curva de supervivencia de los ratones control con vehículo Tlr5–/– (n = 7) mostró una diferencia significativa con respecto a la curva de supervivencia de los ratones control con vehículo Tlr5+/+ (n = 7) (p = 0,03, log-rank p = 0,03, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (fig. 2d). Todos los ratones tratados con ICT o CBLB502 en ambos grupos de cohortes murieron en la semana 6 (Fig. 6b, c, f y g complementarias). De acuerdo con los resultados anteriores (Fig. 2b), los ratones Tlr5+/+ tratados con CBLB502 (dosis baja) + tratamientos ICT dieron como resultado un 20 % de ratones libres de tumores (n = 10) (Fig. 2d y Fig. 6d complementaria, ratones 2 y 4). Mientras que todos los ratones Tlr5–/– tratados con CBLB502 (dosis baja) + tratamientos ICT murieron al final del estudio (n = 10) (p = 0,001, prueba de rango logarítmico; p = 0,01, prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon , en comparación con ratones Tlr5+/+ tratados con CBLB502 (dosis baja) + tratamientos ICT) (Fig. 2d y Fig. 6h complementaria). Estos resultados indican que los receptores del huésped TLR5 son necesarios para las respuestas antitumorales observadas en los ratones tratados con tratamientos CBLB502 y ICT.

Los ratones que mostraron una regresión completa del tumor se volvieron a exponer a inyecciones ortotópicas de células 4T1 FUGW-FL en la cuarta almohadilla de grasa mamaria opuesta (izquierda) sin ninguna terapia adicional (Tabla complementaria 5). La Figura 3a muestra la supervivencia global del experimento de reexposición. Todos los ratones de control de la misma edad, sin tratamiento previo y sin tumor, murieron en la sexta semana, lo que confirma el potencial agresivo de la cohorte de células tumorales, mientras que el 80 % de los ratones expuestos de nuevo estuvieron libres de tumor durante al menos 60 semanas después del tumor. implantación (Fig. 3a-c). Se excluyó un ratón reexpuesto de la curva de supervivencia que se muestra en la Fig. 3a porque la causa de la muerte no estaba relacionada con la implantación del tumor (Fig. 2e complementaria: el vehículo, el ratón 20, murió durante la extracción de sangre para el perfil de citoquinas en la semana tres). Además, una semana después de la reexposición, este ratón mostró una señal bioluminiscente comparable a la de otros ratones reexpuestos (Fig. 7 complementaria), lo que indica una implantación exitosa del tumor. Sin embargo, no se detectaron señales bioluminiscentes o tumor palpable a partir de entonces durante las primeras tres semanas del experimento, lo que indica que el ratón probablemente rechazó la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL. No obstante, en general, estos resultados indicaron que los efectos curativos observados probablemente se debieron a la memoria adquirida para la inmunidad antitumoral.

un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones BALB/c que sobrevivieron al menos 18 semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL y no mostraron signos de tumor, pero se volvieron a desafiar con células tumorales ortotópicas 4T1 FUGW-FL en el contralateral (izquierda) cuarta almohadilla de grasa mamaria (n = 15) y ratones de control de la misma edad sin tratamiento previo con tumor (n = 14). A todos los ratones se les inyectó en la semana 0 células tumorales 4T1 FUGW-FL y se permitió que los tumores crecieran sin intervención terapéutica. Los ratones expuestos nuevamente mostraron una tasa de supervivencia del 80 % (p = 0,0001, prueba de rango logarítmico; p = 0,0001 Gehan-Breslow-Wilcoxon). b Tamaño del tumor de ratones sin tumor (n = 14) medido por imágenes de bioluminiscencia (flujo de fotones total, panel izquierdo) y mediciones de calibre (volumen del tumor, panel derecho). Todos los ratones expuestos a tumores sin tratamiento previo murieron en la semana 6. c Tamaño del tumor de los ratones expuestos de nuevo (n = 15) medido mediante imágenes de bioluminiscencia (flujo de fotones total, panel izquierdo) y mediciones de calibre (volumen del tumor, panel derecho). Solo tres ratones supervivientes del tumor murieron debido a la carga tumoral: Figura complementaria 2f-ratón 23 (ICT), Figura complementaria 2h-ratón 1 (CBLB502 1 µg (it) + ICT) y Figura complementaria 3d-ratón 5 (CBLB502). 10 µg (it)) y, (Tabla complementaria 5). Todos los demás ratones supervivientes del tumor estuvieron libres de tumor durante al menos 60 semanas después de la nueva exposición al tumor ortotópico.

Para ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de respuesta y caracterizar los cambios provocados por las terapias ICT y CBLB502 solas o en combinación, analizamos 32 citocinas transmitidas por sangre periférica de ratones sin tumores de la misma edad (ratones sanos, sin implantación de tumores) y 4T1 Ratones portadores de tumores FUGW-FL bajo nuestras cohortes de tratamiento: portadores de tumores, control de vehículo; portador de tumores, fracaso del tratamiento; y portadores de tumores, respondedores al tratamiento (Fig. 8a-e complementaria), durante la semana 3 (Fig. 4a) y la semana 10 (Fig. 8f complementaria) y las semanas 5 a 7 (Fig. 4c) para 4T1 FUGW-FL tumor- teniendo sólo cohortes de ratones. Es de destacar que los ratones sanos sin tumores mostraron una expresión variable de citoquinas entre las semanas 3 y 10 del estudio, lo que probablemente refleja cambios fisiológicos en la expresión de citoquinas (Fig. 4a y Fig. 8f complementaria, ratones sin tumores).

un mapa de calor de 32 citocinas de sangre periférica de ratones sin tumor y ratones desafiados con tumores 4T1 FUGW-FL tres semanas después de la implantación del tumor ortotópico: ratones sin tumor (ratones sanos, sin tumor implantado); ratones portadores de tumores, control de vehículo (PBS) (no supervivientes), ratones portadores de tumores, tratamiento fallido (no supervivientes) y ratones portadores de tumores, supervivientes a largo plazo. b Gráfica de volcán que destaca la diferencia estadística detectable entre las citocinas de sangre periférica tres semanas después de la exposición al tumor ortotópico. c Mapa de calor de 32 citocinas de sangre periférica de ratones desafiados con tumores 4T1 FUGW-FL de 5 a 7 semanas después de la implantación del tumor: ratones portadores de tumores, control con vehículo (PBS) (no sobrevivientes) en la semana 5; ratones portadores de tumores, tratamiento fallido (no sobrevivientes), semanas 5 a 7; y ratones portadores de tumores, supervivientes a largo plazo durante las semanas 6 y 7. d Gráfica de volcán que destaca la diferencia estadística detectable entre las citocinas de sangre periférica tomadas entre 5 y 7 semanas después de la exposición al tumor ortotópico. e Mapa de calor de 32 citocinas de sangre periférica de ratones reexpuestos con tumor 4T1 FUGW-FL: ratones sin tratamiento previo con tumor, ratones con tumor (no sobrevivientes), ratones sobrevivientes de tumor, falla de reexposición (no sobrevivientes) y ratones sobrevivientes de tumor, sobreviviente de reexposición (sobrevivientes a largo plazo) tomada tres semanas después de la implantación del tumor ortotópico 4T1 FUGW-FL. f Gráfica de volcán que destaca la diferencia estadística detectable entre las citocinas transmitidas por sangre periférica tomadas tres semanas después de la nueva exposición al tumor ortotópico.

De nuestro análisis surgieron cuatro perfiles. En primer lugar, cabe destacar que los niveles de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), una citocina implicada en la proliferación y diferenciación de granulocitos y neutrófilos58 y asociada a una peor supervivencia en cáncer de cuello uterino, pulmón no microcítico, colon, melanoma, y cánceres de piel59,60,61,62,63, mostró un aumento estadístico en ratones con tumor, control de vehículo en comparación con ratones sin tumor tres semanas después de la implantación del tumor 4T1-FUGW-FL (Fig. 4a, b, panel izquierdo, Tabla complementaria 6), y una disminución estadística en comparación con ratones con tumores, respondedores al tratamiento (supervivientes a largo plazo) (Fig. 4a, b, panel central, Tabla complementaria 6). Aunque no hubo una diferencia estadística entre los ratones con tumores que fracasaron en el tratamiento (no sobrevivientes) y los ratones con tumores, los que respondieron al tratamiento (sobrevivientes a largo plazo) tres semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL (Fig. 4a, b, panel derecho, Tabla complementaria 6), hubo una disminución estadística durante las semanas 5 a 7 entre estos dos grupos de ratones (Fig. 4c, d, panel derecho, Tabla complementaria 7). De acuerdo con estos resultados, los ratones con tumores, los que respondieron al tratamiento también mostraron una disminución estadística durante las semanas 5 a 7 en comparación con los ratones con tumores, control del vehículo (Fig. 4c, d, panel central, Tabla complementaria 7). En segundo lugar, CXCL5, una quimiocina involucrada en el reclutamiento de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en el microambiente tumoral64,65,66,67 y asociada con una supervivencia deficiente en cáncer renal, hepático, pancreático y cervical68, mostró una disminución estadística en el tumor. ratones portadores que respondieron al tratamiento (supervivientes a largo plazo) en comparación con ratones portadores de tumores que fracasaron en el tratamiento (no supervivientes) tres semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL (Fig. 4a, b, panel derecho, Tabla complementaria 6). En tercer lugar, encontramos que durante las semanas 5 a 7 posteriores a la implantación del tumor, la IL-15, una citocina proinflamatoria e inmunoactivadora que promueve la supervivencia, la diferenciación, la proliferación y la activación de las células asesinas naturales (NK), CD8+ T y B cell69,70,71,72,73,74,75, mostró un aumento estadístico en los ratones con tumores que respondieron al tratamiento (supervivientes a largo plazo) en comparación con los ratones con tumores que no respondieron al tratamiento (no supervivientes) (Fig. 4c, d, panel derecho, Tabla complementaria 7) o con control de vehículo de ratones portadores de tumores (Fig. 4c, d, panel central, Tabla complementaria 7). Por el contrario, no hubo una diferencia estadística entre los ratones con tumor, el control del vehículo, en comparación con los ratones con tumor que fallaron en el tratamiento (no sobrevivientes) (Fig. 4c, d, panel izquierdo, Tabla complementaria 7). En cuarto lugar, aunque no es estadísticamente significativo según las pruebas de ANOVA de dos vías, los ratones con tumores que respondieron al tratamiento mostraron una tendencia general de aumento de las citoquinas inmunoactivadoras en comparación con los ratones con tumores que fracasaron en el tratamiento durante las semanas 5 a 7 posteriores a la implantación del tumor: GM-CSF (11 veces)76, IL-2 (15 veces)77, IL-13 (8 veces)78, IFN-γ (7 veces)79 y CCL3 (cuatro veces)80. Es de destacar que CXCL1, una quimiocina asociada con la supresión inmune del tumor81, mostró un aumento de 4 veces en los ratones con tumores que fallaron en el tratamiento (Tabla complementaria 7). IL-10, una citoquina involucrada en la supresión inmunológica a través de la inhibición de las células presentadoras de antígenos (APC) y la activación de las células T-reg inmunosupresoras82, mostró una disminución del doble en los ratones que respondieron al tratamiento en comparación con los ratones que fracasaron en el tratamiento ( Tabla complementaria 7). Curiosamente, los antagonistas de IL-10 se están explorando actualmente como terapia inmunológica antitumoral en combinación con agonistas de TLR y otros tratamientos inmunoestimuladores83. Finalmente, los ratones con tumores que respondieron al tratamiento (sobrevivientes a largo plazo) mostraron aumentos estadísticos en IL-1α, IL-15, CXCL5 e IL-12 p40 en comparación con ratones de control sin tumores, lo que indica una activación sistémica inmunitaria distintiva. perfil de citocinas diez semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL (Fig. 8f, g complementarias).

Tres semanas después de la implantación de 4T1 FUGW-FL se analizaron citoquinas de ratones expuestos nuevamente a tumores y sin tratar con tumores. Los ratones que estuvieron libres de tumores durante al menos 60 semanas después de la reexposición (ratones sobrevivientes del tumor, sobrevivientes de la reexposición) revelaron un perfil de citoquinas distintivo de los ratones que fueron reexpuestos, pero desarrollaron tumores (ratones sobrevivientes del tumor, sobrevivientes de la reexposición) falla) (Fig. 4a). Curiosamente, de forma similar a los resultados anteriores con ratones de exposición (Fig. 4c, d), la IL-15 mostró un aumento estadístico en los supervivientes a largo plazo (ratones supervivientes del tumor, supervivientes de la nueva exposición) en comparación con los ratones que recibieron una nueva exposición, pero no no sobrevivieron (ratones supervivientes del tumor, fracaso de la reexposición) (Fig. 4e, f, panel derecho, Tabla complementaria 8) y con ratones sin tumor, portadores de tumores que tampoco sobrevivieron (Fig. 4e, f, panel central, Tabla complementaria Tabla 8). Curiosamente, los ratones reexpuestos que no sobrevivieron (ratones supervivientes del tumor, fracaso de la reexposición) también mostraron un aumento estadístico en comparación con los ratones sin tratamiento previo del tumor, portadores del tumor (Fig. 4e, f, panel izquierdo, Tabla complementaria 8), pero en menor medida que los supervivientes a largo plazo (ratones supervivientes del tumor, supervivientes a la nueva provocación). Además, los niveles de G-CSF también tendieron a ser más bajos en los supervivientes a largo plazo (ratones supervivientes del tumor, supervivientes de la nueva exposición) (disminución de 19 veces) en comparación con los ratones que no tenían tumor y que tenían el tumor (no supervivientes) (Tabla complementaria 8), pero estos valores no alcanzaron la significación estadística (ANOVA de dos vías). Los ratones que fueron reexpuestos, pero que no sobrevivieron (ratones supervivientes del tumor, fracaso de la reexposición), mostraron niveles similares de G-CSF a los ratones sin tumor y portadores de tumores en este punto de tiempo (Tabla complementaria 8). Además, cuatro perfiles surgieron de nuestro análisis. En primer lugar, las citocinas que aumentaron tanto en los ratones que fallaron en la nueva exposición como en los ratones supervivientes de la nueva exposición, pero con un aumento mucho mayor en los supervivientes de la nueva exposición: LIF (5 veces en comparación con 420 veces), CXCL1 (3 veces en comparación con con 120 veces), IL-2 (7 veces frente a 260 veces), IL-7 (100 veces frente a 3700 veces), IL-12 p70 (10 veces frente a 240 veces), CCL4 (3 veces frente a 58 veces), CCL11 (3 veces frente a 27 veces), CCL3 (3 veces frente a 20 veces), IL-1α (4 veces frente a 22 veces), IL -10 (55 veces en comparación con 210 veces), IL-1β (3 veces en comparación con 6 veces), CXCL2 (8 veces en comparación con 17 veces), IL-4 (21 veces en comparación con 41 veces) veces), IL-9 (4 veces en comparación con 7 veces) y M-CSF (40 veces en comparación con 62 veces) (Tabla complementaria 8). En segundo lugar, las citocinas que estaban reguladas a la baja en ambos grupos, pero en mayor medida en la cohorte de fracaso de la nueva provocación: IL-3 (disminución de 0,4 en comparación con 0,7), IL-5 (disminución de 0,3 en comparación con 0,5) y CXCL10 (disminución de 0,3 en comparación con 0,5). con una disminución de 0,5) (Tabla complementaria 8). En tercer lugar, las citocinas que mostraron una regulación diferencial entre las dos cohortes: IL-12 p40 (disminución de 0,4 en comparación con un aumento del doble), TNFα (disminución de 0,5 en comparación con un aumento del doble), IL-6 (disminución de 0,7 en comparación con un aumento de dos veces). aumento de veces) (Tabla complementaria 8). En cuarto lugar, las citoquinas que no cambiaron en una población, pero sí en otra: ratones sobrevivientes expuestos nuevamente aumentaron IL-13 (53 veces), CXCL9 (12 veces), IFN-γ (9 veces), CCL5 (tres -veces), mientras que los ratones que fallaron en la reexposición no aumentaron estas citoquinas más de dos veces. CXCL5 mostró una disminución de 0,8 en los supervivientes a largo plazo, pero ningún cambio en los ratones que no lograron sobrevivir. La IL-17 mostró un aumento del doble en los ratones que no lograron sobrevivir, pero ningún cambio en los supervivientes a largo plazo (Tabla complementaria 8). En conjunto, estos resultados mostraron un perfil de citocinas de activación inmunitaria adaptativa distintiva en los ratones que sobrevivieron al experimento de reexposición.

Para dilucidar aún más los efectos de las terapias CBLB502 y ICT solas o en combinación, exploramos los cambios en el microambiente inmunitario del tumor en respuesta a estas terapias y preguntamos si los cambios en el infiltrado de células inmunitarias se correlacionaban con una mayor probabilidad de supervivencia. Usamos una estrategia única basada en la señal de bioluminiscencia como una herramienta de pronóstico para los resultados de supervivencia de los ratones que fueron sacrificados tres semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL para la extracción del tumor y el posterior perfil de citometría de flujo del infiltrado inmune del tumor, en efecto en un momento antes de los resultados para ratones individuales sería conocido, pero la señal de bioluminiscencia sería predictiva.

Las mediciones del volumen tumoral y del BLI han sido herramientas útiles para evaluar la progresión tumoral en modelos preclínicos84,85,86,87. Además, las mediciones de BLI se han utilizado para evaluar la eficacia del tratamiento en varios modelos animales88,89. Por lo tanto, aprovechamos los datos de supervivencia general y las medidas de progresión del tumor (Fig. 2a, b y la Fig. 2 complementaria) para evaluar el potencial predictivo del resultado de supervivencia de la bioluminiscencia (flujo de fotones total) y/o las mediciones del volumen del tumor 3 semanas después de 4T1 FUGW -FL implantación tumoral. El área bajo la curva (AUC) de la curva característica operativa del receptor (ROC) se utilizó para determinar la precisión diagnóstica general de cada medición, dividiendo el conjunto de datos en "supervivientes" y "no supervivientes" en función de su supervivencia a las 12 semanas90. La Figura 5a muestra que BLI (Log10 flujo total de fotones en la semana 3) tuvo el mejor valor predictivo (AUC = 0,75; IC del 95 %: 0,6 a 0,9; p ≤ 0,001), seguido de cerca por el tamaño del tumor (AUC = 0,74, IC del 95 %: 0,6 a 0,9, p ≤ 0,001) (fig. 5b). Las pendientes del volumen tumoral de la semana 2 y 3 también se utilizaron como cuantificadores, pero no alcanzaron significación (AUC = 0,6, IC del 95 %: 0,5 a 0,7, p ≥ 2) (Fig. 5c). También hubo poca correlación entre Log BLI y la carga tumoral, lo que sugiere que cada medición podría proporcionar información adicional. La precisión diagnóstica predictiva de las mediciones de BLI para los resultados de supervivencia indicó que los ratones con mediciones de BLI más altas tenían una menor probabilidad de supervivencia y que los ratones con mediciones de BLI más bajas tenían una mayor probabilidad de supervivencia.

Curvas ROC que comparan la sensibilidad y la especificidad para la supervivencia general mediante bioluminiscencia (flujo de fotones total) en la semana 3, b volumen del tumor en la semana 3 y c pendiente del volumen del tumor entre las semanas 2 y 3. perfilado

Luego procedimos a examinar los cambios en el microambiente inmunitario del tumor en respuesta a los tratamientos a las tres semanas. Los ratones portadores de tumores 4T1 FUGW-FL se trataron con CBLB502 o ICT solos o en combinación durante una semana y se sacrificaron tres semanas después de la implantación del tumor para la recolección del tumor como se muestra en la Fig. 5d, el esquema y la Tabla complementaria 9. Los tumores se digirieron y prepararon enzimáticamente para análisis de citometría de flujo mediante tinción con anticuerpos dirigidos a células mieloides: células dendríticas, monocitos (Ly6C+), monocitos (Ly6C+, Ly6G+), macrófagos, macrófagos similares a M1 y macrófagos similares a M2 o células linfoides: células B, células NK, Células T CD3+, células T CD8+, células T CD4+ y células T regs (Tablas complementarias 10, 11). Las células mieloides y linfoides se identificaron como se describe en la Tabla complementaria 12.

De acuerdo con observaciones previas de tumores 4T191,92, las células mieloides (células CD11b+) constituyeron la mayoría de las células inmunitarias (células CD45+) presentes en las muestras de tumores tomadas de ratones de control con vehículo (Fig. 9 complementaria; panel de células mieloides, control con vehículo). Sin embargo, las muestras de tumores tomadas de ratones tratados mostraron una tendencia hacia una mayor variabilidad en la cantidad de células mieloides (Fig. 9 complementaria; panel de células mieloides, controles tratados). Esta tendencia podría reflejar las respuestas inmunitarias en curso en los ratones tratados. De hecho, los cambios generales en el panorama inmunitario del tumor en los ratones tratados son heterogéneos y pueden indicar una activación inmunitaria.

Primero, observamos que un aumento en la proporción de monocitos (Ly6C+) y monocitos (Ly6C+, Ly6G+) se correlacionó con una mayor señal de BLI (r = 0.6, p < 0.001 y r = 0.7, p < 0.001) (Fig. 6a, b , violeta oscuro y flechas marrones). Además, un aumento en la proporción de células mieloides, células dendríticas, macrófagos similares a M1, T reg y células NK también se correlacionó con una mayor señal de BLI, aunque sin alcanzar significación estadística (r = 0,4, p > 0,08; r = 0,3, p > 0,08, r = 0,2, p > 0,4, r = 0,01, p > 0,9, r = 0,2, p > 0,4, respectivamente) (Fig. 6a, b). Es digno de mención el aumento en el número de monocitos Ly6C+ y Ly6C+, Ly6G+ entre ratones portadores de tumores con señal BLI aumentada. Se sabe que los tumores 4T1 son potentes inductores de MDSC monocíticas93,94, una población heterogénea de células mieloides pobremente diferenciadas. Se sabe que las MDSC suprimen la activación y proliferación de células T, alteran las funciones de las células asesinas naturales (NK), inducen células T reg inmunosupresoras y promueven estados inflamatorios protumorales mediante la regulación de la comunicación cruzada entre células tumorales, mastocitos y macrófagos95. De acuerdo con estos resultados, encontramos una mayor proporción de células T CD3+ y células T CD4+ inversamente correlacionadas con una mayor señal de BLI (r = −0,6; p ≤ 0,01 y r = −0,5; p ≤ 0,01) (Fig. 6a, b, verde y flechas de color púrpura claro). Además, los aumentos en las células T CD8+, las células B, los macrófagos y los macrófagos similares a M2 mostraron una correlación inversa con el aumento de la señal de BLI, aunque las correlaciones no alcanzaron significación estadística (r = −0,3; p > 0,3, r = −0,3; p > 0,2, r = -0,06, p > 0,9, r = -0,4, p > 0,8, respectivamente) (Fig. 6a, b). En general, estos resultados apuntan a un cambio en el estado del microambiente inmunitario del tumor de la supresión inmunitaria a la activación inmunitaria en ratones con señales BLI más bajas, lo que provoca una respuesta antitumoral curativa posterior.

un perfil de infiltrado inmune tumoral mieloide (panel superior) y linfoide (panel inferior) del vehículo y los ratones tratados, asignado a una medición de Log BLI tomada 3 semanas después de la implantación del tumor 4T1 FUGW-FL y antes de la extracción del tumor. b Gráfica de volcán que destaca la correlación entre el infiltrado inmunitario y Log BLI. La línea vertical marca los valores de correlación r de Spearman negativos y positivos. La línea de identidad indica p = 0,05. Las flechas verde, violeta claro, marrón y violeta oscuro resaltan las células T CD3+, las células T CD4+, los monocitos (Ly6C+, Ly6G+) y los monocitos (Ly6C+), respectivamente, en los paneles A y B.

Finalmente, buscamos corroborar el potencial de diagnóstico de la señal Log (BLI) al comparar el perfil de citocinas transmitidas por la sangre de ratones sobrevivientes a largo plazo (Fig. 4a, b) con ratones con perfil inmunológico (Fig. 8a-e complementaria y Suplementaria tablas 13 a 16). De acuerdo con el perfil de citocinas en sangre periférica de los ratones sobrevivientes a largo plazo, los ratones sacrificados con una señal de Log (BLI) más baja se correlacionaron con una disminución de G-CSF (r = -0.8; p ≤ 0.001) (Figura complementaria 10a, b). Es de destacar que CXCL5, previamente identificado como perjudicial para la supervivencia (Fig. 4b), no mostró diferencias estadísticamente significativas: (r = −0.2; p> 0.5) (Fig. 10a, b complementaria). Sin embargo, es posible que el tamaño de la muestra limite la capacidad de detectar diferencias estadísticas.

El carcinoma de mama 4T1 es un modelo murino robusto para estudiar el cáncer de mama triple negativo humano, que es altamente invasivo, metastásico y resistente a las terapias de puntos de control inmunológico96,97. Aquí informamos: (1) el tratamiento exitoso del carcinoma mamario murino 4T1 refractario a las TIC establecido y el modelo de tumor de melanoma B16-F10 poco inmunogénico y refractario a las TIC a través de la combinación de TIC estándar más potentes agonistas de TLR5 activadores de la inmunidad innata, (2) Los receptores TLR5 del huésped son necesarios para mejorar la supervivencia en ratones tratados con una combinación de ICT más agonista de TLR5 en ratones portadores de tumores 4T1, (3) los tratamientos relacionados con el sistema inmunitario provocaron memoria inmunitaria contra los antígenos tumorales en la mayoría de los supervivientes a largo plazo, (4) citoquinas sistémicas Los perfiles implicaron la participación de la inmunidad innata y adaptativa en respuesta al tratamiento, (5) CXCL5 y G-CSF pueden funcionar como biomarcadores para respuestas positivas al tratamiento, (6) IL-15 apunta a la participación de la inmunidad adaptativa en la obtención de un respuesta antitumoral curativa, (7) un enfoque novedoso que aprovechó la señal BLI no invasiva como un biomarcador de punto medio de progresión tumoral en la semana 3 sirvió como una herramienta predictiva para los resultados de supervivencia en la semana 7 o más tarde, que luego se usó para identificar cambios en el microambiente inmunitario del tumor de punto medio en ratones individuales que mejor se correlacionaron con una mayor probabilidad de supervivencia, y (8) disminuciones en los monocitos (Ly6C+) y monocitos (Ly6C+, Ly6G+) acompañadas de un aumento en las células T CD3+ y CD4 + Las células T probablemente impulsaron el estado del microambiente tumoral de la supresión inmunitaria a la activación inmunitaria. De hecho, debido a que la flagelina bacteriana es el ligando nativo de TLR5, en general, nuestros estudios brindan una mayor comprensión de los mecanismos de los vínculos entre la respuesta a las TIC y la microbiota98,99,100,101.

En conjunto, estos resultados apuntaron a una nueva estrategia terapéutica que aprovechó los componentes innatos y adaptativos del sistema inmunitario para provocar una respuesta antitumoral duradera. Por un lado, se ha demostrado que la flagelina derivada de bacterias provoca una respuesta antitumoral específica al unirse a TLR5, iniciando una cascada de señales que producen una respuesta proinflamatoria a través de la activación del factor de transcripción NF-kB32. En este documento, primero demostramos que CBLB502 in vitro, un potente activador de las vías de señalización de NF-kB, fue suficiente para provocar una respuesta de citocina inmunogénica mediada por TLR5 en células tumorales. Dado que las deficiencias en la presentación de antígenos subyacen a muchos mecanismos de resistencia contra las TIC, es posible plantear la hipótesis de que un potente activador de la inmunidad innata puede modular la homeostasis tumoral, cambiando el estado del microambiente tumoral de supresión inmunitaria a activación inmunitaria (fig. 7). Varias líneas de evidencia apoyan este modelo. En primer lugar, solo el tratamiento con flagelos o CBLB502 en combinación con ICT aumentó la supervivencia en ratones con tumores 4T1 y B16-F10 altamente refractarios a ICT, mientras que las monoterapias con flagelina, CBLB502 o ICT no mostraron efectos curativos significativos. En segundo lugar, los perfiles de citoquinas en sangre periférica de ratones con tumores 4T1 que respondieron al tratamiento y mostraron una regresión completa del tumor reflejaron una respuesta antitumoral concertada. En tercer lugar, los ratones Tlr5-/- no respondieron a la terapia combinada que comprende ICT más agonista de TLR5, lo que indica que los receptores TLR5 del huésped son necesarios para mejorar la supervivencia. Si bien se ha demostrado que los ratones que tienen células tumorales que carecen de TLR5 no responden al tratamiento con flagelina26, queda por estudiar si los flagelos y CBLB502 también pueden actuar sobre las células tumorales para provocar una respuesta inmunitaria curativa en el contexto del tratamiento combinado con ICT. . Además, queda por dilucidar si los receptores TLR5 del huésped actúan principalmente sobre los componentes del eje de la inmunidad innata o si también podrían actuar directamente sobre los componentes de la inmunidad adaptativa para provocar respuestas inmunitarias duraderas en el contexto de las TIC34. En cuarto lugar, casi todos los ratones sobrevivientes que fueron reexpuestos rechazaron el mismo tumor, lo que implica una respuesta de memoria adaptativa contra las células tumorales. En quinto lugar, los perfiles de citocinas periféricas de los ratones que fueron reexpuestos y rechazaron el tumor se alinearon con una fuerte respuesta inmunoactivadora adaptativa. Por último, los cambios en el infiltrado inmunitario del tumor entre los ratones con una mayor probabilidad de supervivencia fueron coherentes con la actividad inmunitaria que condujo a una respuesta antitumoral curativa.

El microambiente tumoral de ratones BALB/c implantados con 4T1 FUGW-FL está altamente infiltrado por células inmunosupresoras que favorecen el microambiente protumoral (panel izquierdo). La activación potente de la inmunidad innata a través de los agonistas de TLR5 en combinación con tratamientos ICT dirigidos a PD-1 y CTLA-4 conduce a aumentos sistémicos en la citoquina activadora inmune IL-15 y a una reducción en las citoquinas inmunosupresoras G-CSF y CXCL5. Al mismo tiempo, la disminución de monocitos (Ly6C+) y monocitos (Ly6C+, Ly6G+), acompañada de un aumento de las células T CD3+ y las células T CD4+, conduce a la activación inmunitaria y a una respuesta antitumoral (panel derecho).

El notable aumento de los niveles de proteína G-CSF en la sangre en ratones con tumores que fallaron en el tratamiento o sirvieron como controles no tratados con tumores sugirió que G-CSF puede explorarse como un biomarcador potencial. Por el contrario, el nivel sérico bajo de G-CSF en ratones portadores de tumores que respondieron al tratamiento o desarrollaron inmunidad tumoral a largo plazo sugirió utilidad como marcador predictivo para la respuesta al tratamiento. Estos resultados aumentan aún más la precaución sobre el uso de G-CSF para prevenir la neutropenia en pacientes con cáncer. Aunque un reciente estudio de metanálisis mostró algunos beneficios de la terapia de apoyo con G-CSF en la supervivencia general de los pacientes que reciben quimioterapia, los datos también muestran un mayor riesgo de desarrollar neoplasias malignas secundarias102. Queda por explorar la terapia con G-CSF en el contexto de las TIC. Asimismo, cabe destacar que los ratones sobrevivientes a largo plazo mostraron disminuciones estadísticamente significativas en CXCL5 en comparación con los ratones que fracasaron en el tratamiento (no sobrevivientes), lo que indica que CXCL5 también puede explorarse como un biomarcador para la respuesta al tratamiento y/o como un objetivo terapéutico potencial. .

En conclusión, el éxito de la terapia de punto de control inmunitario en la obtención de respuestas curativas duraderas contra varios tipos de cáncer en subgrupos de pacientes hace que los esfuerzos para ampliar el número de pacientes que responden a este tipo de tratamiento valgan la pena. Los activadores de TLR5, como la flagelina y el CBLB502, en combinación con las TIC pueden brindar nuevas oportunidades terapéuticas para pacientes que antes no respondían.

La flagelina de Salmonella typhimurium (FLA-ST) se adquirió de Invivogen. CBLB502 fue un regalo de Cleveland Biolabs, Inc. Los anticuerpos monoclonales 9D9 (anti-CTLA-4) y RPM1-14 (anti-PD-1) se compraron de BioX Cell y se mantuvieron en stocks de 6,5 y 6,7 mg/ml, respectivamente, y almacenado a 4 °C antes de su uso. La d-luciferina (d-Luc) (BioGold), el sustrato de la luciferasa de luciérnaga, se mantuvo en una solución de 30 mg/ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Matrigel se obtuvo de Corning y se mantuvo a -20 °C.

Se cotransfectaron células de carcinoma de mama 4T1 (ATCC) con una confluencia del 95 % con 10 µg de pκB5:IκBα-FLuc52 y 3 µg de ADN de plásmido pIRES-puro utilizando Fugene 6 (Roche) en placas de 10 cm (BD Bioscience). Los cultivos se incubaron a 37 °C y después de 24 h, el medio se reemplazó con RPMI fresco complementado con FBS al 10 % inactivado por calor. 24 h más tarde, las células se dividieron en múltiples diluciones en medios que contenían 0,5 µg/ml de puromicina para seleccionar transformantes estables. Después de dos semanas, se obtuvieron imágenes de colonias de células aisladas para confirmar la expresión del gen reportero, y se recolectaron y expandieron colonias bioluminiscentes. Las células indicadoras se cultivaron continuamente en presencia de 0,5 µg/ml de puromicina para mantener la expresión del plásmido indicador.

Células indicadoras de carcinoma mamario 4T1 FUGW103 transfectadas de forma estable con el plásmido EF1α:FLuc que produce células indicadoras de imágenes duales constitutivas fluorescentes y bioluminiscentes (FUGW-FL) se cultivaron de acuerdo con los protocolos de la ATCC y se mantuvieron bajo selección con 0,5 µg/ml de puromicina104. Las células parentales B16-F10 se cultivaron de acuerdo con los protocolos de la ATCC105.

Se añadieron células indicadoras 4T1 κB5:IκBα-FLuc (7000 células) a una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C. Una hora antes de la toma de imágenes, se aspiraron los medios celulares y se reemplazaron con RPMI con L-Glutamato (células 4T1) complementado con FBS al 10 % inactivado por calor y 150 µg/ml de d-luciferina (BioGold). Se tomaron imágenes de las células en un sistema de imágenes IVIS 100, y las imágenes se adquirieron cada 5 min durante 4 h, a menos que se indique lo contrario. Las células se mantuvieron en la cámara de formación de imágenes mediante una platina calentada (37 °C) y un flujo de aire de CO2 al 5 %. Los parámetros de adquisición fueron: tiempo de adquisición, 60 segundos; agrupamiento, 4–8; filtro, abierto; f parada, 1; campo de visión, 12–23 cm. Los estímulos incluyeron: TNFα (20 ng/ml) (sistemas de I+D); flagelina (varias concentraciones que van desde 1 μg/mL a 0,1 ng/mL); CBLB502 (varias concentraciones que van desde 1 μg/mL a 0,1 ng/mL); y agua libre de nucleasas (solo control de vector) añadida a pocillos por triplicado. Los datos de flujo de fotones de bioluminiscencia (fotones/s) representan la media de pocillos por triplicado para el número indicado de experimentos independientes y se analizaron mediante mediciones de región de interés (ROI) con Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). Los datos se importaron a Excel (Microsoft Corp.), se promediaron y se normalizaron a valores iniciales (t = 0) (doblar inicial) y controles tratados con vehículo (doblar vehículo) para presentarlos en gráficos dinámicos50. Los resultados normalizados de experimentos repetidos se promediaron para cada punto de tiempo y los resultados se representaron gráficamente como flujo de fotones normalizado frente al tiempo, con el eje y en una escala log2. Las barras de error positivas representan el error estándar de la media para experimentos repetidos.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas; protocolo 00001179-RN01. Se adquirieron ratones BALB/c hembra (4 semanas de edad) de The Jackson Laboratory. El par de ratones de apareamiento BALB/c Tlr5-/- fue un regalo de Joon Haeng Rhee, Escuela de Medicina de la Universidad Nacional de Chonnam, Corea del Sur106. BALB/c Tlr5-/- fueron criados y mantenidos por el Departamento de Medicina y Cirugía Veterinaria del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Se compraron hembras C57BL/6J (de 6 a 9 semanas) en The Jackson Laboratory. Se permitió que los animales se aclimataran a las instalaciones para animales durante al menos una semana antes del comienzo de los experimentos.

Los ratones que alcanzaron el punto final (estado moribundo o que tenían una medida del tumor en el plano sagital o axial superior a 1,5 cm) se sacrificaron, de acuerdo con los protocolos de eutanasia IACUC del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.

Se estableció un aloinjerto de carcinoma de células mamarias en ratones BALB/c (ratones de 5 a 6 semanas de edad) mediante inyección ortotópica en la cuarta almohadilla de grasa mamaria de aproximadamente 10 000 células 4T1 FUGW-FL mezcladas con Matrigel en una proporción de 2:1. El volumen total inyectado en cada ratón fue de 30 μL.

Se suspendieron flagelina, CBLB502, 9D9 (anti-CTLA-4) y RPM1-14 (anti-PD-1) en PBS filtrada; Se usó PBS filtrado como control de vehículo. Dos semanas después de la inyección ortotópica de células 4T1 FUGW-FL en la almohadilla de grasa mamaria, cada ratón se clasificó aleatoriamente en grupos que recibieron control de vehículo (n = 45, total), o tratamiento solo con flagelina (n = 22), solo CBLB502 (n = 30), solo ICT (9D9 más RPM1-14) (n = 37), flagelina combinada con ICT o CBLB502 combinada con ICT (n = 52). Se administró Flagellin o CBLB502 cada dos días durante dos semanas. Todos los ratones clasificados en diferentes grupos de tratamiento mostraron niveles detectables de señal de bioluminiscencia durante la semana 1 y la semana 2 después de la implantación de células tumorales 4T1 FUGW-FL, lo que confirma la presencia de tumores antes del comienzo del tratamiento (Figuras complementarias 2, 3b-e, 4b- e, 6 y 8b–e). El primer día de tratamiento, se administraron 10 μg de solución de flagelina en 50 μL (PBS), o 10 μg (dosis alta) o 1 μg (dosis baja) de solución de CBLB502 en 50 μL (PBS) por vía intratumoral o intratumoral. inyección intraperitoneal en animales designados. Para cada tratamiento posterior, se utilizaron 2 μg de solución de flagelina en 50 μL (PBS) o 2 μg (dosis alta) o 200 ng (dosis baja) de solución de CBLB502 en 50 μL (PBS). Las TIC se administraron los días 1, 3, 5 y 8 de tratamiento. El primer día, a los ratones que recibieron tratamiento con ICT se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 μg en 100 μL de 9D9 y RPM1-14 (200 μL en total por ratón). En los días posteriores, a cada ratón se le inyectaron 100 μg en 100 μL de cada anticuerpo. En los días en que se administraron flagelina y ICT, los ratones de control del vehículo recibieron dos inyecciones intraperitoneales de 100 μL de PBS o una inyección intraperitoneal de 200 μL de PBS y una inyección intratumoral de 50 μL de PBS. En los días en que solo se administró flagelina, los ratones vehículo recibieron solo 50 μL de inyección intratumoral de PBS, y el día en que solo se administró ICT, recibieron solo dos inyecciones intraperitoneales de 100 μL de PBS o una inyección intraperitoneal de 200 μL de PBS.

Se tomaron imágenes de los ratones usando el sistema de imágenes PerkinElmer IVIS Spectrum semanalmente comenzando una semana después de la inyección ortotópica de células 4T1 FUGW-FL en la almohadilla de grasa mamaria. Los ratones se pesaron al comienzo de cada sesión de imágenes y se inyectaron intraperitonealmente 165 μg de d-luciferina (preparada a 30 mg/mL en PBS) por gramo de ratón. Se tomaron imágenes de los ratones diez minutos después de la inyección con d-luciferin50.

El ADN genómico de los ratones Tlr5+/+ y Tlr5-/- se obtuvo recortando menos de 3 mm de la punta de la cola de los ratones. Las muestras de cola se procesaron utilizando DirectPCR Lysis Reagent Tail (Viagen Biotech Inc), seguido de PCR (Figura complementaria 11a, b). La región genómica que contiene el gen Tlr5 se amplificó utilizando los siguientes cebadores y el protocolo de PCR:

Tlr5-WT: 5′-CTA TCT GGC AAC CAG ATT CAC AGC CTC-3′

Tlr5-KO: 5′-CTA AAG CGC ATG CTC CAG ACT GCC TTG-3′

Tlr5-extra: 5′-CAG GTC GTT AAA TAT CCC AGG TGG AAG-3′

Desnaturalización inicial, 94 °C durante 5 min; desnaturalización, 94 °C durante 1 min; recocido, 62 °C durante 1 min; extensión, 72 °C por 1 minuto, 30 ciclos seguidos de una extensión final, 72 °C por 5 min.

Se estableció un tumor de melanoma en ratones C57BL/6J (Jackson Laboratory, ratones de 6 a 9 semanas de edad) mediante inyección subcutánea en el flanco dorsal derecho de aproximadamente 12 000 células B16-F10. El volumen total inyectado en cada ratón fue de 50 μL de células resuspendidas en RPMI 1640 con medio de L-glutamina (Millipore Sigma).

Tres días después de la inyección subcutánea de células B16-F10 en el costado posterior derecho, cada ratón se clasificó aleatoriamente en un grupo que recibió tratamiento con control de vehículo, solo CBLB502, solo ICT (9D9 más RPM1-14) o CBLB502 combinado con ICT. CBLB502, 9D9 y RPM1-14 se suspendieron en PBS filtrado y se usó PBS filtrado como control del vehículo. Se administró CBLB502 cada dos días durante dos semanas. El primer día de tratamiento, se administró 1 μg en 50 μL de CBLB502 como inyección intratumoral en los animales designados. Para cada tratamiento posterior, se usaron 200 ng en 50 μL de CBLB502. Las TIC se administraron los días 1, 3, 5 y 8 de tratamiento. El primer día, a los ratones que recibieron tratamiento con ICT se les inyectaron por vía intraperitoneal 200 μg en 100 μL de 9D9 y RPM1-14 (200 μL en total por ratón). En los días de tratamiento posteriores, a cada ratón se le inyectaron 100 μg en 100 μL de cada anticuerpo. En los días en que se administraron tanto CBLB502 como ICT, los ratones de control con vehículo recibieron una inyección intraperitoneal de 200 μL de PBS y una inyección intratumoral de 50 μL de PBS. En los días en que solo se administró CBLB502, los ratones vehículo recibieron solo 50 μL de inyección intratumoral de PBS, y el día en que solo se administró ICT, recibieron solo 200 μL de inyecciones intraperitoneales de PBS.

El volumen del tumor se determinó midiendo la longitud (l, la medida más larga) y el ancho (w) de cada tumor al menos una vez a la semana con un calibrador, utilizando la fórmula estándar del prisma triangular para el volumen: V = (l × w2)/2.

Las células indicadoras duales fluorescentes y bioluminiscentes 4T1 FUGW-FL se sembraron en placas de cultivo de tejidos (BD) de 100 mm (750 000 células por placa) y se incubaron durante la noche a 37 °C con RPMI complementado con FBS inactivado por calor al 10 %. En el día dos, se aspiraron los medios celulares y se reemplazaron con RPMI sin FBS al 10 % inactivado por calor. En el día tres, los cultivos se trataron con CBLB502 a 1 µg/ml o PBS como control de vector por triplicado. En el día cuatro, los medios se recogieron en tubos de 15 ml, se centrifugaron a 2000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante se ensayó utilizando la matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón C serie 1000 (RayBiotech).

Los sueros de ratones en los experimentos 6, 7 y 8 (Tabla complementaria 2) se obtuvieron mediante muestreo submandibular. Las muestras se dejaron coagular a temperatura ambiente durante 1 hora, se centrifugaron a 2000 × g durante 10 min a temperatura ambiente y los sueros (fase superior) se recogieron en tubos Eppendorf. Los sueros de ratones en el experimento 9 (Tabla complementaria 2) se obtuvieron mediante muestreo safeno. Las muestras se recolectaron en tubos de separación de suero (Thermo-Fisher), se centrifugaron a 2000 × g durante 10 min a 4 °C y los sueros (fase superior) se recolectaron en tubos Eppendorf. Todas las muestras de suero se almacenaron a -80 °C. Las muestras de sangre no superaron el 10 % del volumen total de sangre circulante107.

Las muestras de suero se analizaron en el Núcleo de proteómica basada en anticuerpos del Baylor College of Medicine, Houston, TX. El núcleo utilizó el panel de citocinas Milliplex Mouse 32-Plex (Millipore), que incluía las siguientes citocinas: G-CSF, GM-CSF, CCL11, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17 , CXCL10, similar a CXCL1, LIF, CXCL5, CCL2, M-CSF, CXCL9, CCL3, CCL4, CXCL2, CCL5, TNF-α, VEGF y controles y estándares de calibración apropiados. Para las citoquinas con valores por encima del rango, informamos el valor más alto observado para la citoquina correspondiente, mientras que para los valores por debajo del rango, informamos el valor más bajo en la curva estándar dividida por la mitad108,109.

Los tumores y los bazos se extirparon con tijeras o fórceps y se pesaron. Los tumores se cortaron en pedazos finos y se transfirieron a medio RPMI (FBS al 5 % + HEPES 10 mM) que contenía colagenasa (0,2 mg/ml) (Clostridium histolyticum, Sigma) y los bazos se suspendieron en PBS. Los tumores se agitaron suavemente a 37 °C durante 30 min antes de la ruptura del tejido. El bazo y los tejidos tumorales se rompieron usando un filtro de células (nylon de 70 µm) (Corning) usando una jeringa. La malla de nailon se enjuagó varias veces con medios. Las muestras se centrifugaron (5 min a 1500 rpm) y se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis RBC (Sigma) durante 5 min y se lavaron 2 veces con tampón de flujo (Thermo Fisher). Se contaron las células (celómetro Nexelom), antes de la tinción viva/muerta con Zombie UV (Biolegend), se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se lavaron 2 veces con PBS. A esto le siguió el bloque Fc (CD16/CD32, BD Biosciences), la tinción de anticuerpos y la preparación de controles de compensación de un solo color (perlas de compensación Ultra Comp eBeads, Thermo Fisher). Las muestras se cubrieron con papel de aluminio y se mantuvieron a 4 °C durante la noche. La tinción intracelular se realizó utilizando el tampón de permeabilización (eBioscience) junto con el juego de tampones de tinción Foxp3/factor de transcripción (eBioscience). Se usaron controles de fluorescencia menos uno (FMO) donde se indicaba para distinguir entre células teñidas positiva y negativamente para FoxP3, Ly6G y Ly6C.

CD45 Violeta brillante 650 (30-F11, Biolegend), CD11b Pe-Cy7 (M1/70, Biolegend), CD11c Violeta brillante 711 (N418, Biolegend), F4/80 PE-dazzle 594 (BM8, Biolegend), Ly-6G APC-Fire 750 (1A8, Biolegend), Ly-6C Violeta brillante 510 (HK1.4, Biolegend), CD80 Violeta brillante 650 (16-10A1, Biolegend), CD163 PerCP-eFluor 710 (TNKUPL, Biolegend) y CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Tabla complementaria 10).

CD45 Alexa Fluor 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5 (6D5, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 650 (17A2, Biolegend), CD4 PerCP-Cy5.5 (GK1.5, Biolegend), CD49b PE-dazzle 594 (DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Brilliant Violet 510 (53–6.7, Biolegend), FoxP3 Alexa 647 (3G3, Thermo-Fisher) y CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Tabla complementaria 10) .

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolegend), CD11b PerCP/Cyanine5.5 (M1/70, Biolegend), CD11c Violeta brillante 510 (N418, Biolegend), F4/80 Violeta brillante 785 (BM8, Biolegend), Ly-6G PE/Cy7 (1A8, Biolegend), Ly-6C Violeta brillante 605 (HK1.4, Biolegend), CD80 Violeta brillante 421 (16-10A1, Biolegend), CD163 APC (S15049I, Biolegend) y CD285 PE (TLR-5 ) (ACT5, BD Biosciences) (Tabla complementaria 11).

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5.5 (1D3/CD19, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 510 (17A2, Biolegend), CD4 PE/Cy7 (GK1.5, Biolegend), CD49b BV421 ( DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Brilliant Violet 711 (53–6.7, Biolegend), FoxP3 Alexa 647 (MF-14, Biolegend) y CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (Tabla complementaria 11).

La citometría de flujo se realizó utilizando un citómetro LSRII (Becton Dickinson). El análisis posterior se realizó utilizando FlowJo 10.7.1 (FlowJo, Becton Dickinson).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California. La supervivencia global se evaluó mediante curvas de Kaplan-Meier110. Se utilizaron las pruebas Log-rank (Mantel-Cox) y Gehan-Breslow-Wilcoxon para comparar las tasas de supervivencia entre tratamientos. Las curvas ROC se calcularon para el análisis predictivo. Se usaron comparaciones bidireccionales de Anova y prueba t múltiple usando el método Holm-Sidak, con alfa = 0.05, para determinar la diferencia estadística detectable en estudios de citoquinas in vitro e in vivo. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson (r) para evaluar la correlación entre la probabilidad de supervivencia y la proporción de infiltrado inmunitario tumoral; Se usó un valor de p de dos colas ≤ 0,05 para determinar la significación estadística detectable.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios, incluidos los Datos complementarios 1.

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Agradecemos el apoyo del Distinguido Presidente Dotado de Gerald Dewey Dodd, Jr. en el MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. El centro de clasificación de células y citometría de flujo del campus sur de MD Anderson cuenta con el respaldo de la subvención de apoyo del Centro de cáncer del NCI (P30 CA016672).

Departamento de Imágenes de Sistemas de Cáncer, Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Caleb González, Sarah Williamson, Seth T. Gammon, Sarah Glazer y David Piwnica-Worms

Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Chonnam, Gwangju, Corea del Sur

Joon Haeng Rhee

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Experimentos diseñados por CG, STG y DPW. CG y SW realizaron experimentos. Datos analizados por CG, SW, STG, SG y DPW. JHR regaló un reactivo. CG, STG y DPW escribieron el manuscrito. Todos los autores editaron el manuscrito.

Correspondencia a David Piwnica-Worms.

El MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas ha presentado una solicitud de patente sobre los compuestos y métodos descritos en este informe (CG, STG y DPW, inventores). Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Shitao Li y Zhijuan Qiu.

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González, C., Williamson, S., Gammon, ST et al. Los agonistas de TLR5 mejoran la inmunidad antitumoral y superan la resistencia a la terapia de punto de control inmunitario. Comun Biol 6, 31 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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Recibido: 20 junio 2022

Aceptado: 23 de diciembre de 2022

Publicado: 12 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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