ANGPTL7, una diana terapéutica para el aumento de la presión intraocular y el glaucoma

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1051 (2022) Citar este artículo

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El glaucoma es una de las principales causas de ceguera. Los medicamentos actuales para el glaucoma funcionan al reducir la presión intraocular (PIO), un factor de riesgo para el glaucoma, pero la mayoría de los tratamientos no se enfocan directamente en los cambios patológicos que conducen al aumento de la PIO, que puede manifestarse como resistencia a los medicamentos a medida que avanza la enfermedad. Para identificar los moduladores fisiológicos de la PIO, realizamos un análisis de asociación de todo el genoma y el exoma en >129 000 personas con mediciones de la PIO y ampliamos estos hallazgos a un análisis del riesgo de glaucoma. Divulgamos la identificación y la caracterización funcional de variantes de codificación raras (incluidas las variantes de pérdida de función) en ANGPTL7 asociadas con la reducción de la PIO y la protección contra el glaucoma. Validamos los hallazgos de la genética humana en ratones al establecer que los ratones knockout para Angptl7 tienen una PIO basal más baja (~2 mmHg) en comparación con el tipo salvaje, con una tendencia hacia una PIO más baja también en los heterocigotos. Por el contrario, el aumento de los niveles de Angptl7 murino mediante inyección en los ojos del ratón aumenta la PIO. También mostramos que el silenciamiento agudo de Angptl7 en ratones adultos reduce la PIO (~ 2–4 mmHg), reproduciendo las observaciones en ratones knockout. En conjunto, nuestros datos sugieren que ANGPTL7 es importante para la homeostasis de la PIO y es susceptible de modulación terapéutica para ayudar a mantener una PIO saludable que pueda prevenir la aparición o retrasar la progresión del glaucoma.

El glaucoma es una de las principales causas de ceguera irreversible, con una prevalencia mundial del 3,54 % en personas de 40 a 80 años de edad, y se prevé que afecte a más de 111,8 millones de personas para 20401. Clasificado como una enfermedad neurodegenerativa, el glaucoma se caracteriza por la progresiva pérdida de células ganglionares de la retina en el ojo y adelgazamiento del borde neurorretiniano de la cabeza del nervio óptico. Los individuos afectados presentan pérdida del campo visual que se acompaña de aumento de la presión intraocular (PIO) en la mayoría de los casos2. El glaucoma primario de ángulo abierto (POAG, por sus siglas en inglés) es el subtipo de glaucoma más común y tiene la mayor prevalencia en personas de ascendencia africana (4,2 % de prevalencia en África1).

Las personas con mayor riesgo de GPAA son mayores de 60 años, tienen antecedentes familiares de glaucoma o miopía alta3,4,5,6. Las características anatómicas y fisiológicas oculares medibles, incluido el espesor corneal central bajo (CCT), el aumento de la relación copa-disco y la presión intraocular (PIO) alta7 se correlacionan con un mayor riesgo de glaucoma y, al igual que el glaucoma8, son altamente hereditarios4,9,10, 11,12,13. Por lo tanto, estos factores de riesgo cuantitativos, cuando se miden en un gran número de individuos, pueden proporcionar un conjunto de datos bien fundamentado para estudios genéticos para dilucidar la etiología del riesgo y la progresión del glaucoma. El último estudio de asociación del genoma completo (GWAS) de la PIO incluyó a más de 130 000 individuos y aumentó el número de loci asociados con la PIO a más de 10014,15. Un GWAS16 anterior informó que ~89 % de los loci asociados con la PIO en un nivel significativo en todo el genoma mostraron efectos direccionalmente consistentes sobre el riesgo de glaucoma, lo que reforzó la utilidad de los factores de riesgo cuantitativos en el descubrimiento de genes para el glaucoma.

Reducir la PIO es el pilar de todos los tratamientos para el glaucoma, ya que la PIO continúa siendo el único factor de riesgo modificable para el inicio o la progresión del glaucoma. Si bien están disponibles muchos agentes tópicos efectivos para reducir la PIO en múltiples clases de medicamentos, tienen inconvenientes importantes, incluido el cumplimiento deficiente debido a los requisitos de dosificación frecuentes y los efectos secundarios17. También se observa una disminución de la eficacia con el tiempo y la consiguiente necesidad de intensificar el tratamiento, quizás en parte porque la mayoría de los medicamentos en uso no abordan los cambios fisiopatológicos en el sitio principal de regulación de la PIO y la salida del humor acuoso del ojo, la malla trabecular (TM). ). Estas limitaciones dan como resultado que una gran proporción de los regímenes de tratamiento del glaucoma comprendan más de un agente terapéutico y que los pacientes cambien de medicación con frecuencia o requieran un aumento del tratamiento que, en última instancia, implica una cirugía invasiva para mantener una PIO clínicamente aceptable18. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad sustancial no satisfecha en el tratamiento del glaucoma para identificar nuevos objetivos terapéuticos que ofrezcan nuevos mecanismos de acción, así como plataformas de tratamiento que puedan ofrecer una mayor durabilidad y tolerabilidad sin comprometer la seguridad.

Realizamos análisis de asociación genética de PIO y glaucoma en ocho cohortes para identificar variantes raras y de codificación que modulan el riesgo de glaucoma a través de la PIO. Esto condujo a la identificación de ANGPTL7 como candidato, de acuerdo con los hallazgos informados recientemente por otro grupo19. En este informe, (1) fortalecemos el vínculo genético con la protección contra el glaucoma al (i) mostrar un efecto protector consistente de la variante Gln175His en ANGPTL7 en ocho cohortes, (ii) identificar una carga de variantes sin sentido ultra raras en ANGPTL7 asociadas con niveles reducidos de PIO, y (iii) identificar una variante rara adicional de pérdida de función de ANGPTL7 en personas de ascendencia africana; también presentamos (2) caracterización in vitro de variantes de ANGPTL7 identificadas a partir de análisis genéticos; y (3) resultados in vivo que muestran que los ratones que carecen de Angptl7 tienen una PIO basal reducida, y que incluso una desactivación parcial de Angptl7 con ARN de interferencia pequeño (siRNA) puede conducir a una reducción de la PIO en ratones. Nuestros resultados establecen un papel importante para ANGPTL7 como regulador fisiológico de la PIO y sugieren que también es susceptible de modificación por herramientas farmacológicas, lo que lo convierte en un objetivo convincente para una terapia de glaucoma.

Estudiamos el efecto de la variación rara que altera las proteínas en la PIO en dos grandes cohortes, UK Biobank (UKB) y Geisinger DiscovEHR (GHS), incluidas 129 207 personas de ascendencia europea después de la exclusión de casos con diagnóstico de glaucoma (Métodos, Tabla complementaria 1). Para aumentar nuestro poder para detectar asociaciones con variantes raras, realizamos pruebas de carga agregando para cada gen todas las pérdidas de función predichas raras (frecuencia de alelos menores (MAF) < 1%) (pLOF, definida como stop-gain, frameshift, donante de empalme, aceptor de empalme, pérdida de inicio y pérdida de pérdida) y variantes de sentido erróneo (predicho perjudicial por 5 algoritmos, Métodos complementarios). Observamos una asociación significativa en todo el genoma (P < 5 × 10-8) de variantes en angiopoyetin-like 7 (ANGPTL7) con PIO reducida (betaallelic = -0.21 SD, P = 5.3 × 10-24; Fig. 1a). La carga de genes incluía 63 variantes raras, pero estaba dominada por dos: una variante sin sentido (Gln175His, MAF = 0,7 %) y una variante stop-gain (Arg177*, MAF = 0,03 %), que representó 1902 y 82 individuos de un total de 2188 transportistas, respectivamente (Figs. 1b, 2, Fig. 1 complementaria). La exclusión de Gln175His y Arg177* del metanálisis de carga entre UKB y GHS no eliminó la señal por completo (betaallelic = –0.23 SD, P = 4.4 × 10−4; Fig. 2 complementaria), lo que sugiere que otras variantes ultra raras en ANGPTL7 también se asocian con una PIO reducida.

a Asociación de un agregado de 63 pLOF y variantes de sentido erróneo nocivas (basadas en 5 algoritmos de predicción) en ANGPTL7 con PIO reducida en 129 207 personas de ascendencia europea. b Variantes de sentido erróneo y pérdida de función prevista (pLOF) en ANGPTL7 y niveles de PIO en individuos de ascendencia europea de UKB. Los gráficos representan los niveles de PIO (IOPg; media de ambos ojos) correlacionados con Goldmann en portadores de 1 pLOF y 10 variantes de sentido erróneo en ANGPTL7 que se predicen perjudiciales por cinco algoritmos diferentes y tienen al menos cinco portadores entre los 101 678 individuos secuenciados con exoma con PIO mediciones en el Biobanco del Reino Unido. La línea roja indica el nivel medio de PIO entre los portadores de las 49 pLOF y las variantes de ANGPTL7 sin sentido predichas y perjudiciales (14,64 mmHg), y la línea azul indica la mediana de la PIO en portadores sin variantes (15,46 mmHg). Los diamantes magenta marcan la mediana de la PIO en los portadores de cada variante. Debajo de los gráficos se encuentra la mediana y el rango intercuartílico (RIC) de la PIO y el número de portadores variantes diagnosticados con glaucoma o controles en UKB (n = 385 040). GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, MAF Frecuencia de alelo menor.

Asociación de variantes Gln175His (a) y Arg177* (c) en ANGPTL7 con PIO, efecto medido en unidades de desviación estándar, en individuos de ascendencia europea. b, d Diagramas de caja que representan la IOPg en el Biobanco del Reino Unido a través de genotipos. b Los portadores heterocigotos y homocigotos de Gln175His tienen una PIOg media más baja de 0,8 mmHg y 4,1 mmHg, respectivamente, en comparación con los no portadores. d Los portadores heterocigotos de Arg177* tienen una PIOg 1,4 mmHg más baja en comparación con los no portadores. GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, MAF Frecuencia de alelo menor.

En los análisis de variante única, Gln175His se asoció con una PIO reducida en un nivel significativo en todo el genoma (betaalélica = -0,20 SD, P = 3,1 × 10-20, Fig. 2a). Los portadores heterocigotos y homocigotos de Gln175His en ANGPTL7 tuvieron una reducción del 5,2 % (0,8 mmHg) y del 26,5 % (4,1 mmHg) en la mediana de la PIO en UKB, respectivamente (Fig. 2b). La variante Arg177* también se asoció nominalmente con una PIO reducida con un tamaño del efecto similar al de Gln175His (betaalélica = −0,24 SD, P = 2,6 × 10–2, Fig. 2c), y los 77 portadores heterocigotos de Arg177* tenían un 9 % (1,4 mmHg) de disminución mediana de la PIO (Fig. 2d). Arg177* parece ser la variante pLOF predominante en las poblaciones europeas; una prueba de carga restringida a variantes de pLOF (15 variantes en UKB y GHS) estuvo dominada por Arg177* (82 de 112 portadores totales) y fue comparable (betaallelic = –0.21 SD, P = 2.2 × 10−2; Fig. 3 complementaria) a la asociación de una sola variante de Arg177* con IOP.

Buscamos otras ascendencias para pLOF adicionales en ANGPTL7 e identificamos Trp188*, que está enriquecido en individuos de ascendencia africana (MAF = 0,3 %) en comparación con los europeos (MAF = 0,0013 %). Realizamos una asociación de Trp188* con PIO en individuos de ascendencia africana de UKB y el estudio de genética de glaucoma afroamericano primario de ángulo abierto (POAAGG), seguido de un metanálisis. Trp188* mostró una tendencia hacia una PIO reducida, similar a Arg177* y Gln175His, pero esto no fue estadísticamente significativo (betaallelic = −0.11 SD, P = 5 × 10−1). Un metanálisis de ascendencia cruzada de las variantes Arg177* y Trp188* mostró una asociación nominalmente significativa con una PIO reducida (betaalélica = –0,21 SD, P = 1,5 × 10−2; Fig. 4 complementaria).

En resumen, observamos una asociación significativa de Gln175His en ANGPTL7 con PIO reducida y una asociación subumbral, en la misma dirección y de magnitud similar, con variantes de pLOF en ANGPTL7. Suponiendo que las variantes de pLOF causen una pérdida de la función de la proteína, nuestros datos sugieren que la pérdida de ANGPTL7 puede conducir a una PIO más baja.

Para comprender si los portadores de variantes en ANGPTL7 también estarían protegidos contra el glaucoma, realizamos un análisis de asociación de Gln175His con glaucoma en UKB, GHS y seis estudios adicionales: la Cohorte de Medicina Personalizada BioMe de Mount Sinai del Sistema de Salud Mount Sinai, Nueva York ( SINAI), el Malmö Diet and Cancer Study de Malmö, Suecia (MALMO), la cohorte FinnGen de Finlandia, el Biobanco de Estonia de la Universidad de Tartu, Estonia (EstBB), el estudio HUNT de Nord-Trøndelag, Noruega (HUNT), y el Estudio de Población General de Copenhague/Estudio del Corazón de la Ciudad de Copenhague de Copenhague, Dinamarca (CGPS-CCHS). Un metanálisis de estas ocho cohortes mostró una reducción significativa en el riesgo de glaucoma para los portadores de Gln175His (odds ratio (ORallelic) = 0,77, P = 2,7 × 10−6, Fig. 3a). También analizamos el riesgo de glaucoma en portadores de las variantes más raras Arg177*/Trp188* en un metanálisis de ascendencia cruzada y observamos una tendencia constante hacia la reducción del riesgo (ORallelic = 0,87, P = 4,1 × 10–1, Fig. 3b) . En conjunto, las asociaciones de variantes missense y pLOF en ANGPTL7 con PIO reducida y la asociación de la variante missense con riesgo reducido de glaucoma sugieren la hipótesis de que la pérdida de ANGPTL7 confiere protección contra el glaucoma, y que este efecto está mediado por la regulación de la PIO.

a Resultados del metanálisis para Gln175His con glaucoma en 8 cohortes diferentes. b Metanálisis de ascendencia cruzada de Arg177* y Trp188* en 5 cohortes de ascendencia europea (EUR) y 3 africanas (AFR). Las variantes en el metanálisis de las cohortes EUR y AFR fueron Arg177* y Trp188*, respectivamente. GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, SINAI Mt. Sinai Medical School BioMe Biobank, MALMO Malmö Diet and Cancer Study, EstBB Estonia Biobank en la Universidad de Tartu, HUNT el estudio HUNT de Nord-Trøndelag, CGPS-CCHS la población general de Copenhague y el estudio del corazón de la ciudad de Copenhague, POAAGG Primary Open Angle African-American Glaucoma Genetics, MAF Frecuencia alélica menor.

Realizamos un análisis de asociación de todo el fenómeno (PheWAS) para comprender si otros rasgos estaban asociados con una carga de pLOF y variantes de sentido erróneo nocivas en ANGPTL7. Probamos el agregado variante ANGPTL7 para la asociación con 14.050 y 10.032 rasgos binarios y cuantitativos en UKB y GHS, respectivamente. Ninguna asociación alcanzó significación en todo el fenoma (P < 2 × 10–6 después de la corrección de pruebas múltiples para 24,082 rasgos totales) en GHS. Las únicas asociaciones significativas en UKB fueron con rasgos oculares (Tabla 1), específicamente con disminución de la PIO compensada por la córnea (IOPcc), disminución del factor de resistencia de la córnea (CRF) y aumento del poder refractivo de la córnea a lo largo de los meridianos débil y fuerte medidos a 3 y 6 mm. diámetros. El efecto de estas variantes en la IOPcc se atenuó ligeramente (–0,17 DE) en comparación con el de la IOPg (–0,23 DE en UKB), lo que sugiere que ANGPTL7 tiene algún impacto en las propiedades de la córnea que se sabe que afectan las mediciones de la IOPg20. La asociación observada con CRF disminuido también es consistente con un efecto corneal de ANGPTL7.

Usamos las mediciones de autorrefracción a 3 mm de diámetro para derivar medidas de interés clínico, a saber, poder refractivo corneal medio (mCRP), astigmatismo corneal y astigmatismo refractivo (métodos complementarios) y verificamos la asociación con ANGPTL7. Observamos una asociación significativa con el aumento de la mCRP (betaalélica = 0,16 DE, P = 1,1 × 10–13, Tabla 1), pero ninguna asociación con el astigmatismo corneal o refractivo. Tampoco observamos asociaciones con el equivalente esférico medio (MSE; medida del error de refracción) o la miopía (derivada de MSE o a través del diagnóstico ICD-10), que podría resultar de un aumento de mCRP (Tabla complementaria 2). En general, nuestros resultados de PheWAS muestran que, si bien ANGPTL7 está asociado con cambios en las medidas cuantitativas relacionadas con la biomecánica/anatomía de la córnea, no detectamos un mayor riesgo de ningún resultado de enfermedad relacionado que pudiéramos probar. Además, pLOF y variantes de sentido erróneo perjudiciales en ANGPTL7 no están asociadas con ningún rasgo cuantitativo sistémico o resultados binarios.

Para comprender el impacto de las variantes Gln175His, Arg177* y Trp188* en la expresión y secreción de ANGPTL7, transfectamos transitoriamente construcciones que expresan las proteínas de tipo salvaje humano (WT), Gln175His, Arg177* y Trp188* en células HEK293. Medimos los niveles de ARNm por Taqman, que mostró niveles de transcripción Gln175His y Arg177 * similares y una tendencia hacia niveles reducidos de la transcripción Trp188 * en comparación con WT (P = 0.08; Fig. 5 complementaria). Sin embargo, el análisis de la proteína intracelular en estado estacionario en el lisado de células completas mediante transferencia Western y ELISA reveló niveles elevados de Gln175His en comparación con WT (P < 1 × 10–4; Fig. 4c). Como era de esperar, Arg177* y Trp188* codificaron proteínas de bajo peso molecular (~30-32 kDa). ELISA no reveló ninguna diferencia significativa en los niveles de proteína de estos dos mutantes en comparación con WT (Fig. 4a, c). Debido a que ANGPTL7 es una proteína secretada, a continuación determinamos los niveles de WT, Gln175His, Arg177* y Trp188* en el sobrenadante celular. El análisis de proteínas por western blot mostró que las variantes Arg177* y Trp188* no eran detectables y que Gln175His se redujo drásticamente en el sobrenadante en comparación con WT (P < 0,05; Fig. 4b). El ensayo ELISA corroboró aún más los niveles severamente reducidos de Gln175His y la incapacidad de Arg177 * y Trp188 * para alcanzar el espacio extracelular (Fig. 4c, d).

a, b La transferencia de Western muestra los niveles de proteína intracelular y extracelular de ANGPTL7 de tipo salvaje (WT), Gln175His, Arg177* y Trp188*. c Se ejecutó ELISA para cuantificar los niveles de proteína intracelular y extracelular de ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177* y Trp188* transfectados transitoriamente en células HEK293 (el lisado de células enteras se diluyó 1:1000; el sobrenadante se diluyó 1:10 000. Ambos el lisado de células completas y el sobrenadante se normalizaron frente a la cantidad total de proteína del lisado de células completas); ****= P < 1 × 10–4 diferencia estadística del lisado de células enteras WT; ^ = P < 0,05, ^^^ = P < 1 × 10–4 diferencia estadística del sobrenadante WT. d Proporción de los niveles de proteína secretada versus intracelular de ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177* y Trp188*. Los niveles de proteína cruda ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177* y Trp188* se normalizaron a la concentración de proteína del lisado completo; **** = P < 1 × 10-4 diferencia estadística de WT. Se repitieron la transferencia Western y el análisis ELISA en tres réplicas biológicas independientes. Se realizaron réplicas técnicas (n = 3) para el análisis ELISA. Los valores de P se calcularon mediante ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey. Todos los datos se presentan como media y las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). Marcador de peso molecular MWt.

Para identificar la expresión de ANGPTL7 en tejidos oculares de diferentes especies, se generaron perfiles transcriptómicos de diferentes partes del ojo (Métodos complementarios). Se observó una alta expresión de ANGPTL7 en la córnea, TM y esclerótica en ojos humanos y de mono verde africano (Fig. 5a, b, Fig. 6 complementaria). También se observó una alta expresión de Angptl7 en la córnea, TM, esclerótica, cabeza del nervio óptico y coroides/RPE en ojos de ratones C57BL/6 J (Fig. 5c). La hibridación in situ en ojos de ratones y donantes humanos usando sondas RNAscope para ANGPTL7 humano y Angptl7 de ratón mostró expresión de ANGPTL7/Angptl7 en TM, estroma de la córnea y esclerótica (Fig. 5d, e; Métodos complementarios).

Los niveles de expresión basados en secuenciación de ARN (medidos en transcripciones por millón, TPM y representados como mediana y rango intercuartílico) son más altos en la córnea, la malla trabecular (TM) y la esclerótica en humanos (a) y mono verde africano (b) ojos y en la córnea, TM, esclerótica, cabeza del nervio óptico y coroides/RPE en ojos de ratón C57BL/6 J (c); La hibridación in situ (RNAscope) muestra la expresión de ANGPTL7/Angptl7 (rojo) en TM, córnea y esclerótica en ojos humanos (d) y murinos (e). Las barras de escala representan 100 μm. La tinción DAPI (azul) contrasta los núcleos celulares. Epitelio pigmentado de la retina RPE, cuerpo ciliar CB, canal de Schlemm SC, músculo ciliar CM, cámara anterior AC, célula ganglionar retiniana RGC, capa nuclear interna INL, capa nuclear externa ONL.

Estudios previos mostraron que la sobreexpresión de ANGPTL7 en células TM conduce a cambios en la deposición y reorganización de la matriz extracelular (MEC)21,22 y que ANGPTL7 aumenta en el humor acuoso de pacientes con glaucoma22; sin embargo, el papel de ANGPTL7 en la regulación de la PIO no está claro. Para investigar esto, inyectamos la proteína mAngptl7 en ratones por vía intravítrea e intracameral y medimos la PIO a lo largo del tiempo. La inyección intravítrea de Angptl7 murino (mAngptl7) en ratones provocó una caída inicial de la PIO seguida, a partir del día 4, de una elevación de la PIO de 4–5 mmHg, un aumento del 22–25 % en comparación con el valor inicial, que duró hasta el final del experimento el día 7 (Fig. 6a). De manera similar, la inyección intracameral de mAngptl7 en ratones provocó una caída inicial y una elevación posterior (de 2 a 5 mmHg) de la PIO, desde el día 3 hasta el final del experimento el día 7 (Fig. 6b). Los ratones a los que se les inyectó vehículo no mostraron un aumento de la PIO en ninguna de las vías de administración.

Se inyectó proteína murina Angptl7 (mAngptl7) en ojos de ratón por vía intravítrea (a) o intracameral (b), y se midió la PIO a lo largo del tiempo. Después de una caída inicial, la PIO permaneció elevada durante varios días en los ojos tratados con mAngptl7 en comparación con los ojos tratados con PBS (CTRL (PBS)). * = P < 0,05; ** = P < 0,01 de significación estadística en comparación con el tratamiento con PBS. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student.

Generamos y caracterizamos ratones Angptl7–/– (KO). Confirmamos a través de RNAscope que el ARNm de Angptl7 no se expresó en ningún tejido ocular en ratones KO, mientras que se expresó en TM, córnea y esclerótica de ratones WT (Fig. 7; Métodos complementarios). Además, el análisis histológico del ojo no mostró diferencias en el ángulo ocular en ratones KO en comparación con WT (Fig. 7 complementaria). No observamos ningún cambio ocular en la tomografía de coherencia óptica del segmento anterior, ni una diferencia en el grosor de la córnea entre los dos genotipos (Fig. 8 complementaria). También monitoreamos la PIO en ratones KO, Angptl+/- (Het) y WT y observamos una disminución de la PIO dependiente de la dosis en los tres genotipos (Fig. 8a). La PIO media se redujo en ratones KO (media ± error estándar de la media (SEM): 15,39 ± 0,25 mmHg) en un 11 % (1,96 mmHg, P < 1 × 10–4) en comparación con WT (17,36 ± 0,23 mmHg). Los ratones Het (16,26 ± 0,43 mmHg) mostraron una reducción más pequeña (6%, 1,1 mmHg, P = 0,02) pero significativa en la PIO en comparación con WT.

El ARNm de Angptl7 no se expresó en ningún tejido ocular en ratones Angptl7 KO, mientras que se expresó en TM, córnea y esclerótica de ratones WT, como se muestra mediante hibridación in situ (RNAscope). Imágenes de campo claro que muestran las siguientes sondas. a Control negativo: DapB. b Control positivo: Ubc (rojo). c Ratones WT: Angptl7 (rojo), y (d) ratones Angptl7 KO: Angptl7 (sin señal). Las barras de escala representan 100 μm.

a La PIO se redujo significativamente en Angptl7 KO en comparación con los ratones Het y WT (media ± SEM; **** = P < 1 × 10–4). b Comparación de la instalación de flujo de salida convencional (C) entre ratones KO y WT. En los ratones KO (n = 7), C aumentó en comparación con los ratones WT (n = 4, P = 0,16, prueba t de Student no apareada). Los datos se presentan como media ± SEM. c La inyección intravítrea con 15 µg de Angptl7-siRNA redujo significativamente la PIO en dos de los seis siRNA probados (n = 6–8/grupo) en comparación con los grupos PBS (n = 6) y Naïve (sin inyección, n = 5) y permaneció reducido a lo largo del final del estudio. Los siRNA 3 y 5 redujeron la PIO entre 2 y 4 mmHg a partir de la semana 2 en comparación con los ratones tratados con PBS. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 1 × 10−3, **** = P < 1 × 10−4 diferencia estadística entre la PIO media para siRNA #5 y PBS- tratamiento.# = P < 0,05, ## = P < 0,01, ### = P < 1 × 10−3, #### = P < 1 × 10−4 diferencia estadística entre la PIO media para siRNA #3 y tratamiento con PBS. d Los resultados de qPCR del anillo limbal microdiseccionado mostraron el nivel más alto de eliminación (> 50 %) del ARNm de Angptl7 con los ARNip n.° 3 y n.° 5 en comparación con los ratones tratados con PBS, lo que es muy consistente con la reducción de la PIO observada en ratones inyectados con estos dos siRNA (b). Los datos se presentan como media y las barras de error representan SEM.

Angptl7 se expresa en gran medida en la córnea y la TM y, dado que utilizamos un tonómetro de rebote Tonolab para medir la PIO, queríamos confirmar aún más que la función de Angptl7 en la córnea no afectaba a la PIO. Por lo tanto, medimos la instalación de flujo de salida convencional utilizando una infusión de flujo constante para comprender la relación entre la PIO y la resistencia al flujo de salida en ratones Angptl7 KO (n = 7) y WT (n = 4). La facilidad de flujo de salida convencional aumentó un 21 % en KO (25,18 nL/minuto/mmHg) en comparación con los ratones WT (20,85 nL/minuto/mmHg; P = 0,15; Fig. 8b). El aumento medio en el flujo de salida fue consistente con la disminución media de la PIO en KO, según la ecuación de Goldman modificada.

Para investigar si la eliminación de Angptl7 con siRNA también puede reducir la PIO, probamos seis siRNA diferentes (Tabla 2) dirigidos a Angptl7 en ratones C57BL/6 J y monitoreamos la PIO a lo largo del tiempo. Inyectamos ratones C57BL/6 J por vía intravítrea con 15 µg de siRNA y realizamos qPCR seis semanas después en anillos limbales disecados de ojos de ratón enriquecidos para la TM. La PIO se redujo significativamente dos semanas después de la inyección en ratones tratados con dos de los seis siRNA (siRNA n.º 3 y n.º 5) en comparación con los grupos PBS e Naïve (sin inyección) (Fig. 8c, Datos complementarios 1). Los animales sin tratamiento previo y tratados con PBS mantuvieron sus PIO al inicio durante la duración del estudio (semanas 0 a 6). En ratones tratados con siRNA n.º 3 y n.º 5, la PIO se redujo en 2–4 mmHg a partir de la semana 2 en comparación con los ratones tratados con PBS (Fig. 8c). Al final del estudio, recolectamos los ojos, microdiseccionamos cuidadosamente el anillo limbal y realizamos qPCR. Observamos el nivel más alto de eliminación (> 50 %) del ARNm de Angptl7 con los siRNA n.° 3 y n.° 5 en comparación con los ratones tratados con PBS (Fig. 8d), lo que es consistente con la reducción de la PIO observada en los ratones inyectados con estos dos siRNA. Estos resultados sugieren que la inhibición aguda de la expresión de Angptl7 también reduce la PIO.

En este estudio, presentamos evidencia genética y funcional del papel de ANGPTL7 en el control fisiológico de la PIO y como un objetivo potencial para la terapia del glaucoma. Una publicación reciente de Tanigawa et al.19 identificó una asociación protectora de ANGPTL7 con glaucoma y en este artículo evaluamos y fortalecemos este hallazgo al (1) agregar seis cohortes a los análisis de asociación genética en UK Biobank y FinnGen que se usaron en Tanigawa et al, y mostrando una tendencia protectora consistente en la mayoría de estos para la rara variante sin sentido, Gln175His (rs28991009); (2) identificar una variante de pLOF enriquecida con ascendencia africana, Trp188*, en ANGPTL7 además de Arg177* en europeos y mostrar que ambas variantes tienden a proteger contra el glaucoma (3) identificar a través de secuenciación del exoma y análisis de carga genética múltiples ANGPTL7 predichos y nocivos variantes asociadas con PIO reducida, lo que indica que puede haber otras variantes de ANGPTL7 ultra raras que confieren protección contra el glaucoma. Juntos, estos nuevos análisis brindan más apoyo para el papel de ANGPTL7 en la regulación de la PIO y la patogénesis del glaucoma. También mostramos a través de ensayos de expresión basados en células, que Gln175His, Arg177* y Trp188* tenían una secreción severamente defectuosa en comparación con el tipo salvaje y, aunque no es una prueba, esta observación es consistente con la hipótesis de que las tres variantes dan como resultado una pérdida de la función de la proteína.

ANGPTL7 es una glicoproteína secretada que se cree que forma homo-oligómeros (tri- o tetrámeros), como otros miembros de la familia ANGPTL23,24. El ARNm de ANGPTL7 se aisló por primera vez de ojos humanos post mortem, donde muestra la expresión más alta en relación con otros tejidos23. Dentro del ojo, nuestros resultados de hibridación in situ muestran que ANGPTL7 se expresa más fuertemente en la córnea y TM, de acuerdo con hallazgos previos22. También hemos demostrado usando RNAseq de una sola célula que la expresión de ANGPTL7 está particularmente enriquecida en el tejido yuxtacanalicular (JCT), una región de la TM más importante para la regulación de la PIO y la generación de resistencia al flujo de salida del humor acuoso25,26. Además de expresarse en tejidos directamente relevantes en el glaucoma, varias líneas de evidencia han implicado a ANGPTL7 en la fisiopatología del glaucoma. En primer lugar, se observaron niveles elevados de proteína y ARNm de ANGPTL7 en tejidos oculares de pacientes con glaucoma en comparación con los controles, y en condiciones de aumento de la PIO simulado por perfusión de explantes del segmento anterior del ojo22,27,28. En segundo lugar, ANGPTL7 es uno de los genes más regulados al alza en respuesta al tratamiento con corticosteroides29,30, lo que puede provocar un aumento de la PIO en ~40 % de la población general y ~90 % de las personas con GPAA31,32. En tercer lugar, los niveles de ANGPTL7 también aumentan en respuesta a TGF-beta, un factor de crecimiento que se cree que modula la ECM y conduce a un aumento de la IOP33. Cuarto, ANGPTL7 en sí mismo puede modular la expresión de componentes de la TM ECM21,22.

Los estudios anteriores sugieren una fuerte correlación de la expresión de ANGPTL7 con el estado de la enfermedad del glaucoma, sin embargo, no son evidencia de una relación causal entre los niveles de ANGPTL7 y la PIO elevada/glaucoma. El hallazgo genético humano de una asociación entre la pérdida de ANGPTL7 y una PIO más baja sugiere que ANGPTL7 es fisiológicamente importante para la regulación de la PIO. Validamos esta hipótesis en ratones donde realizamos experimentos recíprocos: midiendo la PIO después de aumentar los niveles de ANGPTL7 mediante la inyección de mAngptl7 en los ojos del ratón y después de eliminar toda la proteína mAngptl7 generando ratones Angtpl7 KO. Nuestros hallazgos muestran que el aumento de mAngptl7 da como resultado un aumento de la PIO (~ 2–4 mmHg) y la disminución de mAngptl7 a través de ratones KO reduce los niveles basales de PIO (~ 2 mmHg). También observamos una tendencia hacia una mayor facilidad de flujo de salida convencional (~21 %) en los ratones KO en comparación con los ratones WT que era consistente con la disminución de la PIO en los ratones KO. Juntos, estos hallazgos sugieren que ANGPTL7 funciona in vivo para mantener la homeostasis de la PIO. Además, recapitulamos la reducción de la PIO observada en ratones KO mediante la inyección de siRNA en ojos de ratones WT contra Angptl7, que no solo replica la observación en ratones mutantes genéticos, sino que también ilustra que el efecto de mAngptl7 en la PIO continúa después del desarrollo y es susceptible de modulación. por la terapéutica en la edad adulta. Nuestros resultados de PIO más baja en ratones Angptl7 KO son muy consistentes con las observaciones de la genética humana. En base a esto, podríamos extender los hallazgos de la eliminación de siRNA a los humanos y suponer que la inhibición de ANGPTL7 en la edad adulta podría ser una estrategia eficaz para reducir la PIO y, eventualmente, el riesgo de glaucoma.

Nuestros hallazgos genéticos humanos indican que las variantes en ANGPTL7 asociadas con una PIO reducida también se asociaron con una disminución del factor de resistencia corneal (CRF) medio, un resultado del Ocular Response Analyzer que refleja la propiedad elástica de la córnea34, y un aumento del poder refractivo corneal medio ( mCRP). La mCRP, junto con la longitud axial y la potencia de la lente, contribuye al estado refractivo general del ojo35, y el aumento de la mCRP (es decir, una córnea más inclinada) puede ser indicativo de una posible miopía o astigmatismo. Sin embargo, como no observamos evidencia de asociación con miopía o astigmatismo en PheWAS, concluimos que los cambios en mCRP son insuficientes para dar como resultado un resultado de enfermedad o están compensados por otros cambios en rasgos que no se midieron, como la longitud axial36 . Si bien las asociaciones con mCRP y CRF indican claramente un efecto de ANGPTL7 en las propiedades de la córnea, afirmamos que este efecto no puede explicar el alcance total de la reducción de la PIO observada. En cambio, postulamos una contribución independiente de ANGPTL7 a la homeostasis de la PIO basada en lo siguiente: (1) la asociación persistente con una reducción de la PIOcc sugiere que existe una reducción de la PIO incluso después de controlar las propiedades de la córnea; (2) los ojos de los ratones Angptl7 KO muestran una PIO basal reducida sin evidencia de adelgazamiento corneal u otras anomalías corneales; y (3) la asociación de las variantes de ANGPTL7 con la protección contra el glaucoma es un resultado que no esperaríamos si la reducción de la PIO se debiera únicamente al efecto de ANGPTL7 en la anatomía de la córnea37. Por lo tanto, creemos que es probable que ANGPTL7 tenga un efecto pleiotrópico tanto en la PIO como en la anatomía/biomecánica de la córnea en humanos.

La eliminación terapéutica de ANGPTL7 en pacientes con glaucoma de ángulo abierto puede presentar una oportunidad única no solo para reducir la PIO a través de un mecanismo de acción novedoso, sino también para intervenir en el proceso de la enfermedad. Entre los agentes reductores de la PIO más utilizados, ninguno aborda directamente los cambios fisiopatológicos que ocurren a nivel de la TM y, en cambio, reducen la PIO a través de mecanismos que reducen la carga acuosa en la vía convencional, ya sea mediante la supresión de la formación de humor acuoso o aumentando su flujo de salida a través de la vía alternativa. vía uveoescleral)38. En consecuencia, a medida que la disfunción de la TM progresa en un paciente con glaucoma, la intensificación del tratamiento sigue naturalmente18. Si bien se necesitan más estudios para investigar el papel de ANGPTL7 en las vías que contribuyen a la disfunción de la TM y la elevación de la PIO, varias líneas de evidencia apuntan a acciones profibróticas a nivel de la TM, incluida su capacidad de respuesta a corticosteroides y TGF-beta, así como su expresión enriquecida en JCT TM (discutido anteriormente).

Como todos los estudios, este estudio tiene limitaciones. Primero, no tomamos en cuenta el uso de medicamentos para reducir la PIO en el análisis de la PIO. Excluimos del análisis de la PIO a las personas con un diagnóstico de glaucoma, lo que redujo en gran medida el efecto del uso de medicamentos; sin embargo, esto no excluiría a las personas que toman medicamentos para reducir la PIO sin un diagnóstico de glaucoma. Además, la medición de la PIO en UKB para la mayoría de los participantes solo se tomó una vez y, por lo tanto, puede ser propensa a errores contra los que podría amortiguar una mediana de múltiples mediciones. Ambos factores anteriores influirían en la estimación del efecto de variantes genéticas raras en la PIO. En segundo lugar, dado que un diagnóstico de glaucoma a menudo se puede hacer mucho después del inicio de la enfermedad, podemos esperar que un cierto porcentaje de controles tenga glaucoma sin diagnosticar, lo que puede afectar la estimación del tamaño del efecto. En tercer lugar, el gen ANGPTL7 en humanos se encuentra dentro del intrón 28 de MTOR39, por lo que las variantes en ANGPTL7 también podrían afectar la función de MTOR. Si bien es una posibilidad, es poco probable que el efecto sobre la PIO y el glaucoma se deba a MTOR, ya que: (i) se predice que las variantes alterarán las proteínas en ANGPTL7 mientras que no hay un efecto funcional predicho obvio sobre MTOR; (ii) mostramos datos que sugieren que las variantes tienen un impacto funcional en ANGPTL7; y (iii) mostramos datos de ratones que establecen un papel para ANGPTL7 en la regulación de la PIO.

En resumen, nuestros resultados genéticos y farmacológicos indican que ANGPTL7 participa en la regulación fisiológica normal de la PIO en humanos y ratones. Dado que cantidades excesivas de proteína mAngptl7 en los ojos de los animales de experimentación hacen que la PIO se eleve a niveles patológicos, la regulación positiva de ANGPTL7 en humanos puede ser responsable de la PIO elevada que conduce a GPAA. Por lo tanto, proponemos ANGPTL7 como un excelente candidato para explorar como diana terapéutica para GPAA.

Todos los participantes dieron su consentimiento informado y los IRB individuales aprobaron los estudios en las respectivas instituciones. UK Biobank tiene la aprobación del Comité de Ética de Investigación Multicéntrico del Noroeste (MREC), que cubre el Reino Unido. También buscó la aprobación en Inglaterra y Gales del Grupo Asesor de Información del Paciente (PIAG) para obtener acceso a la información que le permitiría invitar a las personas a participar. El estudio DiscovEHR fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en Geisinger. El biobanco BioMe es un biodepósito de investigación en curso aprobado por la Escuela de Medicina Icahn en el IRB de Mount Sinai. El Comité de Ética de la Universidad de Lund aprobó el Malmo Diet and Cancer Study (LU 51–90) y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio CGPS (H-KF-01-144/01) fue aprobado por el Comité de Ética de la Región Capital y por la Agencia Danesa de Protección de Datos. La investigación en el Biobanco de Estonia está regulada por la Ley de Investigación Genética Humana y todos los participantes han firmado un amplio consentimiento informado. La aprobación del IRB para el estudio actual fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad de Tartu, aprobación nr 236/T-23. Para el estudio POAAGG, se obtuvo la aprobación del IRB de la Universidad de Pensilvania para inscribir y volver a contactar a los sujetos. El Biobanco de Finngen fue evaluado y aprobado por el Comité Ético Coordinador del Distrito Hospitalario de Helsinki y Uusimaa.

La asociación con la PIO se probó en un total de 101 678 personas y 27 529 personas de ascendencia europea del Biobanco del Reino Unido (UKB) y la cohorte de la Iniciativa de Salud Comunitaria MyCode del Sistema de Salud Geisinger (GHS), respectivamente. El UKB es un estudio de cohortes basado en la población de personas de entre 40 y 69 años reclutadas a través de 22 centros de pruebas en el Reino Unido entre 2006 y 201040. El estudio GHS MyCode es una cohorte basada en el sistema de salud de pacientes del centro y este de Pensilvania (EE. UU. ) reclutado en 2007–201941. Para las pruebas de asociación de la PIO en personas de ascendencia africana, incluimos 4114 personas de la UKB y 3167 personas del estudio de genética del glaucoma afroamericano de ángulo abierto primario (POAAGG) realizado en la Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania42. Excluimos a todos los participantes con un código de diagnóstico de glaucoma (ICD-10 H40) o glaucoma autoinformado (ID de campo UKB: 6148 y 20002) de los análisis de PIO.

La asociación de las variantes de ANGPTL7 con el glaucoma se probó en 8 estudios: UKB, GHS, Mt. Sinai BioMe cohort (SINAI), Malmö Diet and Cancer Study (MALMO)43, Estonia Biobank (EstBB)44, The Trøndelag Heath Study (HUNT )45, FinnGen, un estudio de Finlandia, y el Copenhagen General Population Study y el Copenhagen City Heart Study (CGPS-CCHS)46. Tuvimos, en total, hasta 40.042 casos (UKB: 12.377, GHS: 8032, SINAI: 409, MALMO: 2395, EstBB: 7629, HUNT: 3874; CPGS-CCHS: 1863; FinnGen: 3463) y 947.782 controles de Europa ascendencia africana y 5153 casos (UKB: 448, POAAGG: 3444, SINAI: 1261) y 21 650 controles de ascendencia africana en análisis de glaucoma.

La PIO en UKB se midió en cada ojo utilizando el Ocular Response Analyzer (Reichert Corp., Buffalo, Nueva York). Los participantes fueron excluidos de esta prueba si informaron haber tenido una cirugía ocular en las 4 semanas anteriores o haber tenido una infección ocular. El Ocular Response Analyzer calcula dos formas de PIO, una PIO correlacionada con Goldmann (IOPg) y una PIO compensada por la córnea (IOPcc). La PIOg se aproxima más a la PIO medida por el tonómetro de aplanamiento de Goldmann (GAT), que ha sido el estándar de oro para medir la PIO, mientras que la PIOcc proporciona una medida de la PIO que se ajusta para eliminar la influencia de la biomecánica corneal47. Para este estudio, nos enfocamos en la IOPg ya que esta medida es la más comparable con las mediciones de la IOP en otras cohortes, y en este documento la IOPg se denominará IOP. La PIO en POAAGG se midió usando un GAT. En GHS, las mediciones de PIO se obtuvieron de varios instrumentos, incluidos GAT, Tono-pen e I-Care, que se correlacionan con las lecturas de PIOg del Ocular Response Analyzer48. Para las personas con GHS a las que no se les recetó ningún medicamento para la PIO, utilizamos la mediana de todas las mediciones de la PIO disponibles. Para las personas a las que se les recetó un medicamento para la PIO, utilizamos la mediana de las mediciones de la PIO disponibles antes de la fecha de inicio de los medicamentos para la PIO (si está disponible). Los individuos para los que no teníamos valores de PIO no medicados fueron excluidos de los análisis genéticos de PIO. Para los análisis de asociación de la PIO, excluimos a las personas con: (1) un diagnóstico de glaucoma; (2) medidas de PIO que estaban a más de 5 desviaciones estándar de la media; (3) más de 10 mmHg de diferencia entre ambos ojos. Derivamos una medida de PIO media entre ambos ojos para cada individuo. Se utilizó la PIO de un solo ojo en los casos en que no se disponía de medidas de PIO para ambos ojos.

Los detalles sobre la definición de glaucoma en cada cohorte se proporcionan en Métodos complementarios. En resumen, los casos de glaucoma en GHS, SINAI, MALMO, HUNT, EstBB, FinnGen (v.R3) y CGPS-CCHS se definieron por la presencia de un código de diagnóstico ICD-10 H40 en los registros de salud electrónicos de pacientes ambulatorios o hospitalizados. En UKB, los casos de glaucoma se definieron como individuos con un diagnóstico ICD-10 H40 o glaucoma autoinformado (ID de campo de UKB: 6148 o 20002). En la cohorte POAAGG, los casos y controles de glaucoma se clasificaron en función de un examen oftalmológico realizado por especialistas en glaucoma, y los casos sospechosos de glaucoma también se incluyeron42.

La secuenciación y el genotipado del exoma completo de alta cobertura se realizaron en el Regeneron Genetics Center49,50 como se describe en Métodos complementarios. Estimamos la asociación con PIO y glaucoma de variantes genéticas o su carga génica utilizando REGENIE v1.0.4351 (UKB, GHS, MALMO, SINAI), SAIGE52 (HUNT, EstBB, FinnGen) o regresión logística (CGPS-CCHS). Los análisis se ajustaron por edad, edad2, sexo, un término de interacción edad por sexo, covariables experimentales relacionadas con el lote y componentes genéticos principales, cuando correspondía. Los detalles del análisis estadístico específico de la cohorte se proporcionan en Métodos complementarios. Los resultados de las cohortes se agruparon mediante un metanálisis ponderado de varianza inversa. Los detalles sobre el análisis PheWAS realizado en UKB y GHS se proporcionan en Métodos complementarios. Los análisis de transferencia Western y ELISA se repitieron en tres réplicas biológicas independientes y los datos se presentan como media ± SEM. Se realizaron réplicas técnicas (n = 3) para el análisis ELISA. Los valores de P se calcularon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey para el análisis de grupos múltiples (Datos complementarios 1). Se usó un total de 12 ojos para probar el efecto de aumentar los niveles de mAngptl7 en ojos de ratón y se usó la prueba t de Student para calcular la importancia del cambio resultante en la PIO. La PIO se midió en 33 ratones WT, 41 Angptl7 KO y 15 Angptl7 Het y la facilidad de flujo de salida convencional se midió en 4 ratones WT y 7 Angptl7 KO. Se utilizó la prueba t de Student para datos no apareados para calcular la significación estadística de los resultados entre los diferentes genotipos. Para la eliminación de siRNA in vivo de mAngptl7, utilizamos 8, 6, 6 y 5 ojos de ratón para siRNA#3, siRNA#5, controles tratados con PBS y Naïve, respectivamente. La significación estadística se calculó utilizando ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Dunnett (Datos complementarios 1).

Las células HEK293, derivadas de Regeneron, se cultivaron en medio DMEM 4,5 g/L de D-Glucosa, (+) L-Glutamina, (–) Fosfato de sodio, (–) Piruvato de sodio suplementado con 10 % de FBS y 1 % de Penicilina-Estreptomicina- Glutamina (Invitrogen), a 37 °C en atmósfera humidificada bajo 5% de CO2. El día antes de la transfección, se sembraron células HEK293 en OptiMEM suplementado con FBS al 10 %. Después de 24 h, las células se transfectaron con FuGENE 6 y 10 µg de pcDNA 3.1 (+) que codifica las siguientes proteínas: ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177* y Trp188*. Después de 24 h, se cambió el medio con FBS OptiMEM al 2 %. Al día siguiente, las células se recolectaron en tampón RIPA, complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (BRAND) o reactivo TRIzol (Invitrogen) para análisis de proteínas y ARN, respectivamente. Los sobrenadantes se transfirieron a un tubo Eppendorf y se congelaron inmediatamente para el análisis de proteínas aguas abajo. El análisis de transferencia Western se realizó usando un anticuerpo policlonal de conejo contra ANGPTL7 a una dilución de 1:1000 (10396-1-AP ProteinTech), usando procedimientos estándar. ANGPTL7 se cuantificó mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (LS-F50425 Life Sciences). Los lisados celulares se diluyeron 1:1000. Los sobrenadantes se diluyeron 1:10.000. La placa ELISA se leyó a 450 nm mediante un lector de placas SpectraMax M4 (Molecular Devices).

El ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen) y el kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se trató con ADNasa I sin ARNasa (Promega). El ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Invitrogen). El análisis Taqman se realizó utilizando TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) en un QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems) y cebadores y sondas disponibles comercialmente para ANGPTL7 (Hs00221727—Applied Biosystems) y GAPDH (Hs02786624_g1—Applied Biosystems).

Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Regeneron y la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión . Regeneron Pharmaceuticals generó ratones Angptl7–/–, con un 63 % de fondo C57BL/6NTac y un 37 % de 129SvEvTac, utilizando la tecnología VelociMouse®53. Se criaron ratones heterocigotos (Angptl7+/-) para generar compañeros de camada de tipo salvaje, het y KO de la misma edad que se usaron para experimentación a los 3-4 meses de edad (género mixto). La anatomía ocular de estos ratones se caracterizó mediante tomografía de coherencia óptica. Los métodos detallados sobre la generación y caracterización de ratones KO se proporcionan en Métodos complementarios. Para los experimentos de ARNsi in vivo, utilizamos ratones macho C57BL/6 J, de 3 a 4 meses de edad, de Jackson Labs.

Los ratones se anestesiaron y se midió la PIO en ambos ojos usando un tonómetro de rebote TonoLab (Colonial Medical Supply, Franconia, NH) antes del inicio de la inyección de Angptl7 y todos los días después durante seis días54,55,56. Al probar los ARNip de Angptl7, se midieron las PIO en cada ojo antes de comenzar el experimento y luego cada semana hasta el final del estudio. Las mediciones de la PIO para ambos ojos se completaron en 3 a 5 minutos. Se realizaron seis mediciones individuales correctas en cada ojo para generar una lectura de PIO. Tomamos cinco lecturas de PIO para cada ojo y usamos el promedio de esas lecturas en cada punto de tiempo.

La facilidad de salida del humor acuoso (C) se midió utilizando nuestra técnica de infusión de flujo constante en ratones vivos55,56,57,58. Los ratones se anestesiaron utilizando un cóctel de ketamina/xilazina 100/10 mg/kg. Se administró de un cuarto a la mitad de esta dosis para el mantenimiento de la anestesia según fuera necesario. Se aplicaron tópicamente una o dos gotas de proparacaína HCl (0,5%) (Bausch + Lomb) en ambos ojos para la anestesia de la córnea. Las cámaras anteriores de ambos ojos se canularon utilizando una aguja de calibre 30 insertada a través de la córnea 1–2 mm por delante del limbo y empujada a través de la cámara anterior hasta un punto en el ángulo de la cámara opuesto al punto de canulación, teniendo cuidado de no tocar el iris, el epitelio de la cápsula anterior del cristalino o el endotelio corneal. Cada aguja de canulación se conectó a un transductor de presión de flujo continuo BLPR-2 previamente calibrado (esfigmomanómetro, Diagnostix 700; American Diagnostic Corporation, Hauppauge, NY, EE. UU.) (World Precision Instruments [WPI], Sarasota, FL, EE. UU.) para la determinación continua de presión dentro del sistema de perfusión. También se administró una gota de genteal (Alcon) en cada ojo para evitar la desecación corneal. Los extremos opuestos del transductor de presión se conectaron a través de un tubo adicional a una jeringa de 1 ml cargada en una bomba de infusión de microdiálisis (bomba de jeringa SP200I; WPI). El tubo, el transductor y la jeringa se llenaron todos con DPBS estéril (Gibco). Las señales de cada transductor de presión se pasaron a través de un amplificador de puente TBM4M (WPI) y un convertidor de analógico a digital (WPI) Lab-Trax a una computadora para mostrarlas en un registrador gráfico virtual (software LabScribe2; WPI). Los ojos se infundieron inicialmente a un caudal de 0,1 μl/min. Cuando las presiones se estabilizaron en 10 a 30 minutos, las mediciones de presión se registraron durante un período de 5 minutos y luego las velocidades de flujo se incrementaron secuencialmente a 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 μl/min. Se registraron tres presiones estabilizadas a intervalos de 3 minutos en cada caudal. El C en cada ojo de cada animal se calculó como el recíproco de la pendiente de un gráfico de la presión media estabilizada en ordenadas frente al caudal en abscisas.

Se usó una aguja de calibre 33 con una microjeringa de vidrio (volumen de 5 uL; Hamilton Company) para inyecciones de proteína Angptl7/ARNip en ojos de ratones. Para las inyecciones intravítreas, se propotosó el ojo y se insertó la aguja a través de la esclerótica ecuatorial hacia la cámara vítrea en un ángulo de aproximadamente 45 grados, teniendo cuidado de no tocar la parte posterior del cristalino o la retina. Se inyectó proteína Angptl7 (n.º de catálogo 4960-AN-025; R&D Systems, Minneapolis, MN) o siRNA (de Alnylam Pharmaceuticals, Supplementary Methods) o PBS (1 ul) en el humor vítreo en el transcurso de 1 minuto. Luego se dejó la aguja en su lugar durante 45 s más (para facilitar la mezcla), antes de retirarla rápidamente. Las secuencias de ARNip para las seis sondas analizadas se proporcionan en la Tabla 2. Antes y durante las inyecciones intracamerales de proteína Angptl7, los ratones se anestesiaron con isoflurano (2,5 %) que contenía oxígeno (0,8 l/min). Para la anestesia tópica, ambos ojos recibieron una o dos gotas de HCl de proparacaína al 0,5% (Akorn Inc.). Se propoto cada ojo y se insertó la aguja a través de la córnea justo por encima de la región limbal y en la cámara anterior en un ángulo paralelo a la córnea, teniendo cuidado de no tocar el iris, el epitelio de la cápsula anterior del cristalino o el endotelio corneal. Se inyectó hasta 1 µl de proteína Angptl7 o PBS en cada ojo durante un período de 30 s antes de retirar la aguja. Solo se administró una inyección el día 0.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen subyacentes a las cifras principales se proporcionan en Datos complementarios 1. Las imágenes sin recortar y sin editar de las transferencias que aparecen en el artículo principal se proporcionan en Datos complementarios 2. Toda la secuenciación del exoma completo, el chip de genotipado y la secuencia imputada descritos en este informe están disponibles públicamente. a investigadores registrados a través del protocolo de acceso a datos del Biobanco del Reino Unido. La información adicional sobre el registro para acceder a los datos está disponible en http://www.ukbiobank.ac.uk/register-apply/. Más información sobre la secuencia completa del exoma está disponible en https://www.ukbiobank.ac.uk/media/kqjmdwfg/access_064-uk-biobank-exome-release-faq_v10.pdf. La información detallada sobre el chip y la secuencia imputada está disponible en: https://www.ukbiobank.ac.uk/media/cffi4mx5/ukb-genotyping-and-imputation-data-release-faq-v3-2-1.pdf. Los datos de genotipado y secuenciación del exoma de DiscovEHR y la Universidad de Pensilvania pueden ponerse a disposición de investigadores calificados, académicos y no comerciales previa solicitud a través de un acuerdo de transferencia de datos con Geisinger Health System y la Universidad de Pensilvania, respectivamente. Los datos genéticos de las cohortes HUNT, CGPS-CCHS y Estonia pueden estar disponibles poniéndose en contacto con las respectivas instituciones. Se puede acceder a los datos de FinnGen R3 en: https://www.finngen.fi/. Los materiales de Regeneron descritos en este manuscrito pueden estar disponibles para investigadores académicos calificados previa solicitud a través de nuestro portal (https://regeneron.envisionpharma.com/vt_regeneron/). En determinadas circunstancias en las que no podamos proporcionar un reactivo patentado en particular, se puede proporcionar una molécula alternativa que se comporte de manera similar. Se puede obtener información adicional sobre cómo compartimos nuestros materiales poniéndose en contacto con la dirección de correo electrónico de colaboraciones preclínicas de Regeneron ([email protected]).

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Queremos agradecer a todas las personas que hicieron posible este trabajo. En particular: el equipo del UK Biobank, sus patrocinadores, los dedicados profesionales de las instituciones miembros que contribuyeron y apoyaron este trabajo, y muy especialmente los participantes del UK Biobank, sin los cuales esta investigación no sería posible. La secuenciación del exoma fue financiada por el Consorcio de Secuenciación del Exoma del Biobanco del Reino Unido (es decir, Bristol Myers Squibb, Regeneron, Biogen, Takeda, AbbVie, Alnylam, AstraZeneca y Pfizer). Esta investigación se ha realizado utilizando el recurso del biobanco del Reino Unido con el número de solicitud 26041; EstBB, agradecemos a todos los participantes y al personal del biobanco de Estonia por su contribución a esta investigación y el trabajo analítico de EstBB se llevó a cabo en parte en el Centro de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad de Tartu. LM y KK fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación de Estonia PRG184 y por la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Proyecto No. 2014-2020.4.01.15-0012); Queremos agradecer a los participantes e investigadores del estudio FinnGen. También agradecemos a los participantes de la Iniciativa de Salud Comunitaria MyCode por participar en la colaboración DiscovEHR. Esta investigación recibió financiación de Regeneron Pharmaceuticals. JOB recibió el apoyo del Instituto Nacional del Ojo (#R01EY023557-01), Vision Research Core Grant (P30 EY001583) y NIH Grant (LM010098). Los fondos también provienen de FM Kirby Foundation, Research to Prevent Blindness, The UPenn Hospital Board of Women Visitants y The Paul and Evanina Bell Mackall Foundation Trust. El Departamento de Oftalmología de la Escuela de Medicina Perelman y el Hospital VA en Filadelfia, Pensilvania, también brindaron apoyo. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. El Estudio de Salud de Trøndelag (Estudio HUNT) es una colaboración entre el Centro de Investigación HUNT (Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, NTNU, Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología), el Consejo del Condado de Trøndelag, la Autoridad Regional de Salud de Noruega Central y el Instituto Noruego de Salud Pública. Salud. El genotipado en HUNT fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud; Universidad de Michigan; el Consejo de Investigación de Noruega; el Comité de Enlace para la Educación, la Investigación y la Innovación en Noruega Central; y el Comité Conjunto de Investigación entre el hospital de St Olav y la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, NTNU. SS recibió financiación del Fondo de Investigación Independiente, Dinamarca (líder de Investigación Sapere Aude, número de subvención 9060-00012B). VRMC recibió fondos de R21EY028273-01A1 y la subvención de la Fundación Lisa Dean Moseley.

Centro de Genética Regeneron, Tarrytown, NY, 10591, EE. UU.

Kavita Praveen, Lauren Gurski, Ariane H. Ayer, Trikaladarshi Persaud, Lawrence Miloscio, Silvio Alessandro Di Gioia, Stephen Chen, Eric Jorgenson, Dadong Li, Alexander Li, Eli Stahl, Dylan Sun, Tanya M. Teslovich, Goncalo R. Abecasis, Michael Cantor, Andrew Deubler, Aris Economides, Luca A. Lotta, John D. Overton, Jeffrey G. Reid, Alan Shuldiner, Katherine Siminovitch, Christina Beechert, Caitlin Forsythe, Erin D. Fuller, Zhenhua Gu, Michael Lattari, Alexander Lopez, Thomas D. Schleicher, Maria Sotiropoulos Padilla, Louis Widom, Sarah E. Wolf, Manasi Pradhan, Kia Manoochehri, Ricardo H. Ulloa, Xiaodong Bai, Suganthi Balasubramanian, Suying Bao, Boris Boutkov, Siying Chen, Gisu Eom, Lukas Habegger, Alicia Hawes, Shareef Khalid, Olga Krasheninina, Rouel Lanche, Adam J. Mansfield, Evan K. Maxwell, Mona Nafde, Sean O'Keeffe, Max Orelus, Razvan Panea, Tommy Polanco, Ayesha Rasool, William Salerno, Kathie Sun, Amelia Averitt, Nilanjana Banerjee, Sameer Malhotra, Deepika Sharma, Jeffery C. Staples, Ashish Yadav, Joshua Backman, Amy Damask, Lee Dobbyn, Manuel Allen Revez Ferreira, Arkopravo Ghosh, Christopher Gillies, Hyun Min Kang, Michael Kessler, Jack Kosmicki, Nan Lin, Darren Liu, Adam Locke, Jonathan Marchini, Anthony Marcketta, Joelle Mbatchou, Arden Moscati, Charles Paulding, Carlo Sidore, Kyoko Watanabe, Bin Ye, Blair Zhang, Andrey Ziyatdinov, Michelle G. LeBlanc, Jason Mighty, Lyndon J. Mitnaul, Nirupama Nishtala, Nadia Rana, Marcus B. Jones, Gonzalo R. Abecasis, Michael N. Cantor, Katia Karalis, Aris Economides, Giusy Della Gatta, Manuel A. Ferreira, Aris Baras & Giovanni Coppola

Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, Nueva York, 10591, EE. UU.

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Centro KG Jebsen de Epidemiología Genética, Departamento de Salud Pública y Enfermería, NTNU, Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología, 7030, Trondheim, Noruega

Ben Brumpton, Bjørn Olav Åsvold y Kristian Hveem

Centro de Investigación HUNT, Departamento de Salud Pública y Enfermería, NTNU, Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología, 7600, Levanger, Noruega

Ben Brumpton, Bjørn Olav Åsvold y Kristian Hveem

Clínica de Medicina, Hospital St. Olavs Hospital Universitario de Trondheim, 7030, Trondheim, Noruega

Ben Brumpton

Centro del Genoma de Estonia, Instituto de Genómica, Universidad de Tartu, Tartu, Estonia

Kristi Krebs, Andres Metspalu, Mari Nelis, Reedik Mägi, Tõnu Esko & Lili Milani

Departamento de Endocrinología, Clínica de Medicina, Hospital St. Olavs, Hospital Universitario de Trondheim, 7030, Trondheim, Noruega

Bjørn Olav Åsvold

Departamento de Oftalmología, Facultad de Medicina Pearlman, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania, EE. UU.

Venkata RM Chavali, Harini V. Gudiseva, Rebecca Salowe y Joan M. O'Brien

Alnylam Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA, 02142, EE. UU.

Sarah Hyde, Stephanie Lefebvre, James Mclninch y Scott Waldron

Bayer AG, productos farmacéuticos, investigación y desarrollo, 13342, Berlín, Alemania

Claudia Schurmann

Departamento de Bioquímica Clínica, Rigshospitalet, Hospital Universitario de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Anne-Sofie Seidelin, Anne Tybjærg-Hansen y Stefan Stender

División de Medicina Cardiovascular, Departamento de Medicina Interna, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

cristen willer

Departamento de Medicina Computacional y Bioinformática, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

cristen willer

Departamento de Genética Humana, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

cristen willer

Universidad de Lund, Departamento de Ciencias Clínicas Malmö, Malmö, Suecia

Olle Melander

Hospital Universitario de Skåne, Departamento de Emergencia y Medicina Interna, Malmö, Suecia

Olle Melander

Geisinger, Danville, Pensilvania, 17821, EE. UU.

Lance J. Adams, Jackie Blank, Dale Bodian, Derek Boris, Adam Buchanan, David J. Carey, Ryan D. Colonie, F. Daniel Davis, Dustin N. Hartzel, Melissa Kelly, H. Lester Kirchner, Joseph B. Leader, David H. Ledbetter, J. Neil Manus, Christa L. Martin, Raghu P. Metpally, Michelle Meyer, Tooraj Mirshahi, Matthew Oetjens, Thomas Nate Person, Christopher Still, Natasha Strande, Amy Sturm, Jen Wagner y Marc Williams

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Todos los autores contribuyeron a la revisión crítica del manuscrito para el contenido intelectual importante y la aprobación final de la presentación del manuscrito para su publicación. Conceptualización: KP, GP, AB, CR y GC Conservación de datos: DL, MNC Análisis genético: KP, LG, MAF, AHA, SADG, AL, TMT, CS, DS, KK, BB, SS, ES, EJ Adquisición de fondos : GDY, GRA, AB, JMB, CR, LM, OM, SS, KH Experimentos con ratones: GP, BP, SW, HY, WF, SZ, JSR, WF Diseño y desarrollo de siRNA: SL, JM, S.Waldron, SH Experimentos in vitro: GDG, TP, LM, MDS Administración de proyectos: EC, MBJ Conjuntos de datos: JMB, VRMC, HVG, RS, BB, KH, BOA, CW, KK, LM,. SS, COMO, EN,. Supervisión de OM: MAF, GDG, YH, KH, LM, KK, AE, JW, AB, CR, GC Redacción: borrador original: KP, GP, GDG, TVZ, CR, GC Todos los autores contribuyeron a obtener financiamiento, diseño del estudio y vigilancia. Todos los autores revisaron la versión final del manuscrito (Equipo de gestión y liderazgo de RGC). CB, CF, AL y JDO realizaron y son responsables del genotipado de muestras. CB, CF, EDF, ML, MSP, LW, SEW, AL y JDO realizaron y son responsables de la secuenciación del exoma. TDS, ZG, AL y JDO concibieron y son responsables de la automatización del laboratorio. MSP, KM, RU y JDO son responsables del seguimiento de muestras y del sistema de gestión de información de la biblioteca. XB, AH, OK, AM, SO, RP, TP, AR, WS y JGR realizaron y son responsables de la logística informática, el análisis y la infraestructura necesaria para producir datos de exomas y genotipos. GE, MO, MN y JGR proporcionaron soporte operativo y desarrollo de infraestructura informática. SB, S.Ba, SC, KS, SK y JGR proporcionaron anotaciones de variantes y genes y su interpretación funcional de las variantes. EM, RL, BB, AB, LH, JGR concibieron y son responsables de crear, desarrollar y desplegar plataformas de análisis y métodos computacionales para analizar datos genómicos. Todos los autores contribuyeron a la informática clínica del proyecto (Informática Clínica). Todos los autores contribuyeron al análisis analítico del proyecto (Genética Traslacional y Analítica). Todos los autores contribuyeron a la gestión y coordinación de todas las actividades de investigación, planificación y ejecución. Todos los autores contribuyeron al proceso de revisión de la versión final del manuscrito (Gestión del Programa de Investigación).

Correspondencia con Aris Baras, Carmelo Romano o Giovanni Coppola.

Los autores declaran los siguientes intereses contrapuestos: Los autores de Regeneron reciben salario y opciones propias y/o acciones de la empresa. El cónyuge de CW es un empleado del Regeneron Genetics Center. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a Saidas Nair, Lulin Huang y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Eve Rogers. Los informes de revisores están disponibles.

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Praveen, K., Patel, GC, Gurski, L. et al. ANGPTL7, una diana terapéutica para el aumento de la presión intraocular y el glaucoma. Comun Biol 5, 1051 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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Recibido: 03 Septiembre 2021

Aceptado: 01 septiembre 2022

Publicado: 03 octubre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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