Klotho en Osx+

Signal Transduction and Targeted Therapy volumen 7, Número de artículo: 155 (2022) Citar este artículo

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Los defectos óseos maxilofaciales se observan con frecuencia en la práctica clínica. Una comprensión más clara de la red reguladora que dirige la formación de hueso maxilofacial promoverá el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para la regeneración ósea. La vía de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) es fundamental para el desarrollo del hueso maxilofacial. Klotho, una proteína transmembrana de tipo I, es un componente importante de los complejos receptores de FGF. Estudios recientes han informado de la presencia de expresión de Klotho en hueso. Sin embargo, el papel de Klotho en el desarrollo y la reparación craneoesqueléticos sigue siendo desconocido. Aquí, usamos una estrategia genética para informar que la eliminación de Klotho en progenitores mesenquimales positivos para Osx conduce a una reducción significativa en la osteogénesis en condiciones fisiológicas y patológicas. Los progenitores mensenquimatosos deficientes en Klotho también suprimen la osteoclastogénesis in vitro e in vivo. En condiciones de inflamación y pérdida ósea inducida por trauma, encontramos que Klotho ejerce una función inhibitoria sobre la señalización de TNFR inducida por inflamación al atenuar la expresión de Rankl. Más importante aún, mostramos por primera vez que Klotho está presente en el hueso alveolar humano, con un patrón de expresión distinto tanto en condiciones normales como patológicas. En resumen, nuestros resultados identifican el mecanismo por el cual Klotho expresado en progenitores mensenquimales Osx+ controla la diferenciación de osteoblastos y la osteoclastogénesis durante la formación y reparación del hueso alveolar mandibular. La señalización mediada por Klotho es un componente importante de la remodelación y regeneración del hueso alveolar. También puede ser un objetivo para futuras terapias.

El hueso maxilofacial tiene funciones fisiológicas cruciales, como la formación de la estructura facial, la protección de los sistemas digestivo y respiratorio y el soporte de los tejidos blandos adyacentes y las estructuras dentales.1 Los defectos óseos en la región maxilofacial se observan a menudo en la práctica clínica. Las causas más comunes incluyen inflamación, trauma, cáncer oral y defectos congénitos de nacimiento.2 El tratamiento de los defectos y la regeneración del hueso siempre ha sido un desafío debido a sus características únicas, los requisitos estéticos del esqueleto facial y los cambios físicos significativos que pueden provocar. a la angustia psicosocial.3 Existen diferencias obvias entre los huesos maxilofaciales y la mayoría de los demás huesos debido a su origen embrionario distintivo, formación ósea y estructura.4 Por lo tanto, dilucidar los mecanismos del desarrollo y reparación del esqueleto maxilofacial es esencial para permitir la innovación en estrategias terapéuticas para el tratamiento. de defectos óseos maxilofaciales.

La vía de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) es esencial en el desarrollo del hueso maxilofacial. Las mutaciones genéticas humanas en los receptores de FGF se han identificado como causas de múltiples anomalías en el crecimiento y desarrollo del esqueleto craneofacial.5 Klotho (KL) es una proteína transmembrana de tipo I que es un componente esencial de los complejos del receptor 1 de FGF (FGFR1).6 El papel principal de Klotho anclado a la membrana es actuar como un co-receptor para el factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), ya que aumenta la capacidad de unión de FGFR1 a FGF23. FGF23 es una hormona secretada principalmente por los osteocitos y los osteoblastos y sirve para mantener la homeostasis de los iones minerales.7 Klotho se expresa predominantemente en el riñón, la glándula paratiroides y el plexo coroideo.8 Estudios recientes han identificado transcritos de Klotho en el hueso, lo que implica una importante función reguladora de Klotho en el metabolismo óseo. 9 Los ratones hipomórficos con Klotho tienen una masa ósea baja y un recambio óseo reducido. debido a hiperfosfatemia e hipervitaminosis D. Otro estudio usó Prx1Cre para extirpar condicionalmente Klotho en células madre mesenquimales. Los ratones Prx1Cre;KLfl/fl revelaron un fenotipo esquelético comparable al de los controles; pero estos ratones no pudieron aumentar la expresión de FGF23 en el esqueleto en condiciones urémicas.10 Desde el descubrimiento de Klotho en los osteocitos,9 Komaba et al. demostraron que la ablación de Klotho específica de osteocito resultó en un aumento sorprendente en la formación ósea junto con una actividad osteoblástica mejorada.11 La discrepancia en el fenotipo esquelético de estos modelos de ratón posiblemente se debió a un papel distinto de Klotho en diferentes poblaciones de células óseas.

Debido a los linajes embrionarios específicos y al patrón de desarrollo, la mayor parte del esqueleto craneofacial se origina a partir de las células de la cresta neural y se forma por osificación intramembranosa y endocondral, mientras que el esqueleto de las extremidades es el producto de las células mesodérmicas de la placa lateral y se somete a la formación de hueso endocondral.12 Por lo tanto, la función de Klotho puede variar según las regiones del esqueleto. Es de destacar que los pacientes con enfermedades genéticas como la calcinosis tumoral, que se asocia con una mutación sin sentido en Klotho, sufren anomalías craneofaciales graves13, lo que subraya el papel esencial de Klotho en el desarrollo óseo craneofacial. Sin embargo, la función reguladora de Klotho en la osificación del hueso maxilofacial, así como en la patogenia de la pérdida y reparación del hueso maxilofacial, sigue siendo desconocida.

En este estudio, generamos un nuevo modelo de ratón con una ablación dirigida de Klotho en células progenitoras mesenquimales Osterix+ (Osx+) para estudiar estas cuestiones. La inactivación de Klotho en los progenitores Osx+ provocó deformidades esqueléticas, incluida la disminución de la formación de hueso alveolar mandibular y la disminución de la resorción ósea. Esto condujo a un volumen óseo alveolar anormalmente alto durante el desarrollo. Además, hemos descubierto los mecanismos reguladores utilizados por Klotho expresado en progenitores mesenquimales para afectar la osteoclastogénesis. Descubrimos que, en respuesta a la pérdida de hueso alveolar y la lesión traumática, Klotho tiene un papel fundamental en la promoción de la osteogénesis durante la reparación ósea al tiempo que inhibe la resorción ósea inducida por inflamación al dirigirse a la señalización del factor de necrosis tumoral y la expresión de Rankl. Además, informamos por primera vez la presencia de Klotho en el hueso alveolar humano y su patrón de expresión distinto en condiciones tanto sanas como patológicas.

Investigamos un posible papel de Klotho en el desarrollo óseo maxilofacial mediante la ablación condicional de la expresión de Klotho en progenitores mesenquimales que expresan Osx. Esto se logró cruzando ratones KLfl/fl con ratones OsxCre (Fig. 1a, b complementarias). Los ratones OsxCre; KLfl / fl nacieron con la tasa esperada de herencia mendeliana y tenían un peso corporal similar en comparación con los compañeros de camada de control (Fig. 1c complementaria). Los niveles séricos de Ca2+, Pi y FGF23 intacto no se alteraron en ratones OsxCre; KLfl/fl, lo que nos permitió aislar la función específica de tejido de Klotho (Fig. 1e complementaria). La tinción con rojo de alizarina / azul alcián no detectó cambios significativos en la mineralización esquelética en el hueso craneofacial de ratones neonatales OsxCre; KLfl / fl (Fig. 1f complementaria). A las 3 semanas después del nacimiento, el análisis de μCT reveló un volumen óseo alveolar comparable en el área de furcación de los primeros molares mandibulares en ratones y controles OsxCre;KLfl/fl (Fig. 1a). Los mutantes aumentaron ligeramente, pero no significativamente, el volumen óseo/volumen de tejido (BV/TV, %, p = 0,180) y una disminución en la separación trabecular (Tb.Sp, μm, p = 0,051) (Fig. 1b). Observamos un volumen óseo alveolar significativamente mayor en estos ratones knockout condicionales en una etapa posterior en comparación con los controles de compañeros de camada (Fig. 1c). El análisis cuantitativo de μCT reveló BV/TV (p = 0,012) y grosor trabecular (Tb.Th, mm, p = 0,020) significativamente más altos en los mutantes en comparación con los compañeros de camada de control. No se observó diferencia en Tb.Sp (p = 0,170) (Fig. 1d). También realizamos la tinción H&E del hueso mandibular de ratones de 3 y 11 semanas de edad. No es sorprendente que la masa ósea trabecular en el área de la furcación fuera mayor en los ratones OsxCre;KLfl/fl. No se observaron cambios en la histología de los molares mandibulares (Fig. 1e, f).

La deficiencia de Klotho en las células Osx+ provoca una alteración de la remodelación ósea. a, c Reconstrucción tridimensional a partir de tomografías microcomputarizadas del hueso alveolar de ratones OsxCre;KLfl/fl y sus compañeros de camada de control a las 3 (a) y 11 semanas de edad (c). b, d Análisis cuantitativos de volumen óseo/volumen de tejido (BV/TV, %), grosor trabecular (Tb.Th, μm) y separación trabecular (Tb.Sp, μm) en 3- (b, n = 5 en OsxCre y n = 8 en OsxCre; grupo KLfl/fl) y ratones de 11 semanas (d, n = 3). e, f Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) del hueso alveolar en la bifurcación de la raíz del primer molar mandibular en ratones de 3 (e) y 11 semanas de edad (f). Las ampliaciones más altas de las áreas encuadradas muestran un aumento de la masa ósea alveolar en ratones OsxCre;KLfl/fl. n = 5. g, h Marcaje doble con calceína del hueso alveolar de ratones control y OsxCre;KLfl/fl. Imagen representativa (g) y análisis cuantitativos de la tasa de formación ósea/superficie ósea (BFR/BS, μm3/μm2/día), tasa de aposición mineral (MAR, μm/día) y superficie de mineralización/superficie ósea (MS/BS, %) (h). n = 8. i Doble tinción de fluorescencia de RUNX2 y OSX:GFP. Los aumentos más altos de las áreas encuadradas muestran la distribución de células positivas para RUNX2 y OSX:GFP en la bifurcación de la raíz del primer molar. j, k Cuantificación de células positivas para RUNX2 o OSX:GFP/osteoblastos totales en ratones de 3 (j) y 11 semanas de edad (k). n = 6 en el grupo OsxCre y n = 4 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. l Tinción TRAP. Las ampliaciones más altas de las áreas encuadradas muestran que el número de células positivas para TRAP disminuyó en ratones OsxCre;KLfl/fl. m Cuantificación de células TRAP-positivas/superficie ósea en ratones de 3 (izquierda) y 11 semanas (derecha). n = 4 en el grupo OsxCre y n = 5 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. n Análisis qRT-PCR de la transcripción de Acp5, Mmp9, Rankl, Opg y Rankl/Opg en ratones de 11 semanas de edad. n = 4 en el grupo OsxCre y n = 6 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Barra de escala, 1 mm (a, c), 200 μm (e), 50 μm (g, i) y 100 μm (l)

El aumento del volumen óseo alveolar en los ratones ablacionados con Klotho podría deberse a un desequilibrio en la formación y resorción ósea. Por lo tanto, realizamos histomorfometría dinámica en el hueso alveolar. Los resultados mostraron que la superficie mineral/superficie ósea (MS/BS), la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea/superficie ósea (BFR/BS) estaban marcadamente reguladas a la baja en ratones OsxCre;KLfl/fl en comparación con los controles (Fig. 1g, h). A continuación, determinamos las actividades de las células del linaje de osteoblastos mediante tinción inmunofluorescente. Si bien la cantidad de células positivas para el factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2) no cambió en ratones mutantes, la eliminación de Klotho redujo significativamente la inmunorreactividad de Osx (Fig. 1i-k). En general, Runx2 define las células progenitoras comprometidas con el preosteoblasto, mientras que la expresión de Osx significa la diferenciación a un osteoblasto.14 Estos resultados sugieren que la ablación de Klotho afectó principalmente la actividad y la maduración de los osteoblastos.

La tinción con fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) reveló una disminución significativa de la superficie ósea / osteoclastos positivos para TRAP en el hueso alveolar de ratones OsxCre; KLfl / fl en comparación con los controles de la misma edad (Fig. 1l, m). Además, los genes relacionados con la diferenciación y activación de los osteoclastos, como Acp5 (Trap) y la metaloproteinasa de matriz 9 (Mmp9), se suprimieron notablemente en los mutantes. A continuación, evaluamos los factores clave secretados por los osteoblastos para mediar la resorción ósea y encontramos una reducción del activador del receptor del ligando del factor nuclear κ B (Rankl), un aumento de las expresiones de osteoprotegerina (Opg) y una menor relación Rankl/Opg en el hueso alveolar, lo que implica un mesenquimatoso de Klotho. efecto dependiente del progenitor sobre la osteoclastogénesis (Fig. 1n).

Establecimos una función fundamental de Klotho en el desarrollo del hueso alveolar in vivo, por lo que a continuación exploramos cómo la pérdida de Klotho inhibía la osificación. Aislamos el ARN total de las mandíbulas de ratones OsxCre; KLfl/fl y OsxCre y lo sometimos a secuenciación de ARN (RNA-seq). El transcriptoma global se alteró significativamente entre el control y los ratones ablacionados con Klotho. Entre un total de 26,758 genes expresados, 510 genes estaban regulados al alza mientras que 432 genes estaban regulados a la baja en las mandíbulas sin Klotho (Fig. 2a). Se encontró que los reguladores cruciales asociados con la osteogénesis, como la fosfoproteína ácida de la matriz de dentina 1 (Dmp1), la fosfoproteína 1 secretada (Spp1), el colágeno tipo I alfa 2 (Col1α2) y la osteomodulina (Omd), estaban significativamente suprimidos en los mutantes ( Figura 2b). En consecuencia, el análisis de ontología génica (GO) mostró que los genes que estaban regulados negativamente por la deficiencia de Klotho se expresaron altamente durante el desarrollo del sistema esquelético, la osificación, el desarrollo de tejidos biominerales, etc. (Fig. 2c).

Klotho favorece el desarrollo del sistema esquelético al promover la diferenciación osteogénica. un diagrama de Venn que muestra 510 genes regulados al alza de manera única, mientras que 432 genes regulados a la baja en las mandíbulas con ablación de Klotho (valor p < 0,05). n = 3. b Mapa de calor de genes representativos asociados con la osteogénesis. El rojo indica expresión regulada al alza; azul indica expresión regulada a la baja. c Análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) de genes regulados a la baja en genes expresados diferencialmente (DEG) totales. d Tinción con fosfatasa alcalina (ALP) y tinción con rojo de alizarina (ARS), respectivamente, a los 7 días (7d) y 14 días de inducción osteogénica en osteoblastos craneales primarios de ratones OsxCre y OsxCre;KLfl/fl. n = 3. e Transcripción de Osx, Runx2, Alp, Dmp1, Col1α1 y Rankl después de la inducción 14d. n = 3. f Tinción de ALP y ARS después de transfectar partículas de lentivirus para sobreexpresar Klotho (OE) o carga vacía (NC). n = 3. g Transcripción de genes después de 14 días de inducción. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Todos los datos se muestran como la media ± SEM

Continuamos nuestra investigación sobre el papel de Klotho de los precursores de Osx+ en la mediación de la osteogénesis in vitro. Se cultivaron osteoblastos de ratones OsxCre y OsxCre;KLfl/fl. Después de 7 y 14 días de cultivo en condiciones osteogénicas, los osteoblastos con eliminación de Klotho habían disminuido significativamente la fosfatasa alcalina (ALP) y la intensidad de la tinción con rojo de alizarina (ARS), acompañada de marcadores osteogénicos regulados a la baja, incluidos Osx, Runx2, fosfatasa alcalina (Alp) , Dmp1 y colágeno tipo I alfa 1 (Col1α1), lo que indica una diferenciación osteogénica disminuida (Fig. 2d, e). Por el contrario, los osteoblastos de KLfl/fl se transfectaron mediante lentivirus para sobreexpresar Klotho y se cultivaron en medios osteogénicos. La sobreexpresión de Klotho conduce a intensidades de ALP y ARS marcadamente aumentadas, acompañadas de niveles de expresión más altos de marcadores relacionados con la osteogénesis (Fig. 2f, g). Estos datos implican que Klotho mejora el desarrollo del esqueleto craneofacial al acelerar la diferenciación osteogénica de las células Osx+.

Los datos anteriores indican que Klotho en los osteoblastos es importante para la formación de hueso alveolar mandibular. Por lo tanto, determinamos si la eliminación de Klotho afectaría la pérdida ósea patológica in vivo. Primero establecimos un modelo estándar de periodontitis apical (AP). Con este fin, la pulpa dental de los primeros molares mandibulares en ratones OsxCre;KLfl/fl y control se expuso al microambiente oral. μCT reveló que se encontró una pérdida significativa de hueso alveolar en el primer molar mandibular de los ratones OsxCre;KLfl/fl y de control 3 semanas después de la inducción del modelo. Sorprendentemente, los ratones OsxCre;KLfl/fl AP mostraron un área radiolúcida más profunda caracterizada por un área de lesión periapical significativamente mayor y un factor de patrón trabecular (Tb.Pf, 1/μm), así como una raíz dental más corta en comparación con el grupo control AP (Fig. 3a, b, Fig. 2a, b complementaria). El examen histológico mostró que tanto los ratones OsxCre;KLfl/fl como los de control tenían estructuras periapicales conservadas en condiciones normales. La PA condujo a la infiltración de células inflamatorias que rodeaban el ápice de los dientes afectados, acompañada de un aumento de la reabsorción ósea alveolar (Fig. 3c). El análisis de la expresión génica demostró que AP provocó un aumento de los niveles de expresión del factor de necrosis tumoral-α (Tnf-α) y la interleucina-6 (Il-6) en comparación con los controles (Fig. 3d).

La deleción de Klotho promueve la lesión periapical en el hueso alveolar. a Imágenes μCT del primer molar mandibular de OsxCre;KLfl/fl y ratones de control en periodontitis apical y grupos simulados. La flecha roja representa la lesión periapical. b Análisis cuantitativo del área de la lesión periapical que incluye el área periapical (mm3) y el diámetro periapical (μm), n = 5; y parámetros de hueso esponjoso que incluyen BV/TV (%), Tb.Th (μm), factor de patrón trabecular (Tb.Pf, 1/μm) y Tb.Sp (μm), n = 6 en el grupo OsxCre Sham y AP, n = 7 en el grupo OsxCre;KLfl/fl Sham y n = 8 en el grupo OsxCre;KLfl/fl AP. c La tinción H&E de las mandíbulas muestra la lesión periapical inducida por la periodontitis apical. La línea discontinua muestra el rango de lesión periapical. n = 5. d Expresión de transcripción de Tnf-α e Il-6 en hueso periapical. n = 5. e, f Tinción TRAP y cuantificación de células TRAP-positivas/superficie ósea. Los aumentos más altos de las áreas encuadradas muestran más células positivas para TRAP en la región de la lesión de los ratones OsxCre;KLfl/fl. n = 3. g Tinción de inmunofluorescencia para RANKL en la región periapical. Las áreas encuadradas muestran una mayor expresión de RANKL en el grupo OsxCre;KLfl/fl AP. Las líneas discontinuas amarillas representan la interfaz de la raíz distal del primer molar. h Expresión génica de Rankl, Opg y relación Rankl/Opg en hueso periapical del primer molar mandibular. n = 4 en el grupo OsxCre Sham y OsxCre;KLfl/fl AP, n = 5 en el grupo OsxCre-AP y n = 3 en el grupo OsxCre;KLfl/fl Sham. i Inmunofluorescencia doble tinción de OSX:GFP y tdTomato en hueso periapical que rodea la raíz distal del primer molar mandibular. Las áreas encuadradas muestran mayores aumentos de OSX:GFP y células doblemente positivas de tdTomato en hueso periapical. La punta de flecha blanca indica células doblemente positivas. j Cuantificación de células doblemente positivas OSX:GFP y tdTomato. n = 4 en el grupo OsxCre-sham, n = 13 en el grupo OsxCre-AP, n = 8 en el grupo OsxCre;KLfl/fl-sham y n = 12 en el grupo OsxCre;KLfl/fl-AP. *, $, #p < 0,05, **, ##p < 0,01, ***, ###p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * indica PA versus simulacro, $ indica OsxCre Sham frente a OsxCre;KLfl/fl Sham, # indica OsxCre AP frente a OsxCre;KLfl/fl AP. Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Barra de escala, 200 μm (a, c), 100 μm (e) y 50 μm (g, i)

Es de destacar que los ratones con ablación de Klotho exhibieron un número notablemente mayor de osteoclastos y raíces dentales más severamente rotas que los ratones de control, lo que sugiere que la resorción ósea es elevada en la pérdida ósea inflamatoria en ausencia de Klotho (Fig. 3e, f). También vale la pena señalar que las lesiones de AP muestran una expresión de Rankl elevada para la diferenciación de osteoclastos.15 De hecho, en el sitio de la lesión de AP, los ratones OsxCre;KLfl/fl tenían una expresión de Rankl aumentada en comparación con los ratones de control, lo que era consistente a nivel de transcripción (Fig. 3g, h). Mientras tanto, la expresión de Opg se redujo con la inflamación, lo que condujo a la relación Rankl/Opg más alta en ratones ablacionados con Klotho con AP (Fig. 3h). La pérdida ósea es autolimitada en la mayoría de los casos de PA, debido a un equilibrio recién establecido entre la reabsorción ósea y la formación ósea.16 Por lo tanto, a continuación examinamos si una deficiencia en Klotho afectaría este proceso regulador protector durante la PA. Generamos ratones de control y mutantes que expresan el gen tdTomato para visualizar las células del linaje Osx+ durante la progresión de la pérdida ósea periapical inducida por la infección. Las células que expresan Osx y su progenie evaluadas por la expresión de tdTomato inducida por OsxCre se detectaron abundantemente en la pulpa dental, el ligamento periodontal, así como en osteoblastos y osteocitos en el hueso alveolar (Fig. 3i). El doble etiquetado inmunofluorescente de tdTomato y GFP mostró que AP indujo significativamente la generación de células Osx: GFP+, que también eran tdTomato+ (Fig. 3j). Esto sugiere que el microambiente apical patológico preserva hasta cierto punto la capacidad de formación de tejido duro al aumentar la diferenciación osteogénica. Más importante aún, se detectó una reducción significativa en las células doblemente positivas Osx:GFP/tdTomato en los mutantes, lo que implica el potencial osteogénico deteriorado de las células que carecen de Klotho.

Además, evaluamos la función de Klotho en la reparación del hueso alveolar mediante la generación de un modelo de curación de la cavidad alveolar. La reconstrucción μCT volumétrica en 3D reveló que la curación del hueso en el sitio de extracción se completó en los ratones de control 21 días después de la extracción del diente. Sin embargo, los mutantes tenían una superficie ósea menos organizada y un retraso en la curación de la cavidad alveolar (Fig. 4a). Luego se evaluó el hueso regenerado que ocupaba el sitio de curación. Hubo una disminución significativa en BV/TV y densidad mineral ósea (DMO) en el hueso recién formado de ratones OsxCre;KLfl/fl. No se observaron diferencias en superficie ósea/volumen óseo (BS/BV), número trabecular (Tb. N) y Tb. Sp en mutantes (Fig. 4b). Los ratones OsxCre;KLfl/fl tenían menos hueso alveolar interconectado en el alvéolo de extracción, acompañado de un área de médula ósea aumentada (Fig. 4c). La remodelación ósea después de la extracción dental se logra mediante la coordinación de osteoblastos y osteoclastos,17 por lo que a continuación enumeramos los osteoclastos en la superficie ósea. Había abundantes osteoclastos adheridos a la superficie ósea de los alvéolos en proceso de curación en ambos grupos. Sin embargo, el número de osteoclastos por perímetro óseo aumentó significativamente en ratones OsxCre; KLfl / fl (Fig. 4d, e). El doble marcaje inmunofluorescente mostró osteoblastos Runx2 positivos estadísticamente reducidos en células deficientes en Klotho alrededor del hueso trabecular en la cavidad. Del mismo modo, se detectaron menos osteoblastos GFP+/tdTomato+ en ratones con deficiencia de Klotho en comparación con los controles (Fig. 4f, g), lo que sugiere que la eliminación de Klotho condujo a la supresión de la diferenciación de osteoblastos tras una lesión traumática. Tomados en conjunto, estos resultados indican que los alvéolos de extracción de curación más lenta en ratones OsxCre;KLfl/fl podrían deberse a una reducción en la osteogénesis acompañada de una reabsorción ósea acelerada.

La reparación ósea alveolar se atenúa en ratones OsxCre;KLfl/fl. a, b Imágenes de μCT y análisis cuantitativos de la cicatrización ósea en el alvéolo de extracción del diente. Las elipses blancas indican el alvéolo de extracción en el maxilar. La punta de flecha azul indica el retraso en la cicatrización del alveolo dental. n = 3 en el grupo OsxCre y n = 5 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. tinción c–e H&E y TRAP del alvéolo de extracción dental de ratones control y OsxCre;KLfl/fl. Los aumentos más altos de las áreas encuadradas muestran menos reparación ósea y más células positivas para TRAP en el alvéolo de ratones OsxCre;KLfl/fl. n = 3 en el grupo OsxCre y n = 6 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. f La tinción de inmunofluorescencia de RUNX2 y el etiquetado de doble fluorescencia de OSX:GFP y tdTomato muestran una reducción de los osteoblastos positivos para Runx2 u OSX:GFP y tdTomato en ratones con deleción de Klotho. g Cuantificación de células positivas para RUNX2 o células doblemente positivas para OSX:GFP y tdTomato en el zócalo. n = 4 en el grupo OsxCre y n = 7 en el grupo OsxCre;KLfl/fl. *p < 0,05, **p < 0,01. Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Barra de escala, 500 μm (a), 200 μm (c), 100 μm (d) o 50 μm (f)

Los modelos de periodontitis apical y extracción dental generados para este estudio confirmaron el efecto adverso de la deleción de Klotho en la reparación de tejidos al mediar en la actividad tanto de los osteoblastos como de los osteoclastos. El mecanismo por el cual la deficiencia de Klotho en las células del linaje de los osteoblastos media la resorción ósea se estudió utilizando osteoblastos derivados de calvaria cocultivados con osteoclastos derivados de médula ósea. Klotho se eliminó mediante la administración de Cre mediada por adenovirus (Ad-CRE) a osteoblastos obtenidos de ratones KLfl/fl (Fig. 5e). Los osteoblastos con deficiencia de Klotho demostraron una capacidad reducida para apoyar la osteoclastogénesis, como lo indica el número reducido de células multinucleadas TRAP+ (Fig. 5a, b). Realizamos un ensayo de reabsorción de fosa en un sistema de cocultivo de osteoblastos-osteoclastos para determinar la actividad de los osteoclastos. De acuerdo con los resultados de la tinción TRAP, los osteoclastos en el cocultivo con células osteoblásticas deficientes en Klotho tenían una actividad de reabsorción reducida en comparación con los osteoblastos de control (Fig. 5c, d). Examinamos los factores clave secretados por los osteoblastos para ajustar la actividad de los osteoclastos y descubrimos que la expresión de Rankl estaba regulada a la baja en los osteoblastos con ablación de Klotho mientras que estaba regulada al alza en células con sobreexpresión de Klotho (Fig. 2e, g). Además, Rankl se reguló a la baja después de ser transfectado por Ad-CRE en osteoblastos de ratones KLfl/fl (Fig. 5f). Estos datos demostraron que el Klotho osteoblástico actúa de forma no celular autónoma para mediar en la diferenciación y la actividad de los osteoclastos.

Osteoblast-Klotho media en la formación de osteoclastos y suprime la activación del receptor I de TNF inducida por TNF-α. a–d Los osteoblastos primarios de ratones KLfl/fl se transfectaron con Cre mediada por adenovirus (Ad-CRE), se utilizó Ad-GFP como control. Osteoblastos transfectados y macrófagos derivados de médula ósea (BMM) cocultivados bajo TNF-α o tratamiento con vehículo. a, b Tinción TRAP y análisis cuantitativos después de 9 días de inducción. n = 3. c, d Ensayo de reabsorción de fosas después de 13 días de inducción. n = 4. e Expresión génica de Klotho en osteoblastos de ratones KLfl/fl después de la transfección con adenovirus. n = 6. f Transcripción del gen Rankl relacionado con la osteoclastogénesis. n = 3. g de células MC3T3 sobreexpresadas con Klotho se trataron con TNF-α (10 ng/mL, 60 min) o vehículo seguido de ChIP para Klotho. El ADN se cuantificó mediante qPCR y los resultados se mostraron como enriquecimiento en veces frente a IgG de control. n = 3. h GO análisis de enriquecimiento de genes regulados al alza en DEG. n = 3. i Expresión génica de Tnfr1 en modelo AP de OsxCre;KLfl/fl y ratones de control. n = 6 en los grupos OsxCre-sham y OsxCre-AP y n = 3 en los grupos OsxCre;KLfl/fl-sham y OsxCre;KLfl/fl AP. j Inmunocitoquímica de Klotho y TNFR I en progenitores con sobreexpresión de Klotho. k La inmunocitoquímica muestra la distribución de NF-κB p65 en el citoplasma y el núcleo. l Cuantificación de la expresión de TNFR I durante la estimulación con TNF-α. n = 4 en los grupos NC-CTRL y OE (Sobreexpresión de Klotho)-TNF-α; n = 6 en los grupos NC-TNF-α y OE-CTRL. m Cuantificación de la translocalización nuclear de NF-κB p65. n = 3 en los grupos NC-Vehicel y NC-TNF-α; n = 4 en los grupos OE-Vehicle y OE-TNF-α. n Expresión génica de Rankl en osteoblastos primarios y osteoblastos con deleción de Klotho cuando se tratan con TNF-α en combinación con R-7050 (inhibidor de TNFR I). n = 3. o El ensayo de coinmunoprecipitación se realizó en células MC3T3 sobreexpresadas con Klotho. Las proteínas se recogieron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos Klotho o TNFR I. Se realizó Western blot utilizando anticuerpos Klotho o TNFR I para determinar la interacción entre Klotho y TNFR I. Inmunoprecipitación IP. *, $, †p < 0,05, **, ##, §§p < 0,01, ***,$$$, §§§p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * indica AP frente a simulado, o Vehículo frente a TNF-α. $ indica OsxCre Sham frente a OsxCre; KLfl/fl Sham, o vehículo NC frente a vehículo OE. # indica vehículo Ad-GFP frente a vehículo Ad-CRE, OsxCre AP frente a OsxCre; KLfl/fl AP, o NC-TNF-α frente a OE-TNF-α. § indica TNF-α frente a TNF-α + R-7050. † indica Ad-GFP TNF-α + R-7050 frente a Ad-CRE TNF-α + R-7050. Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Barra de escala, 100 μm (a, c) y 50 μm (j, k)

Los defectos óseos maxilofaciales pueden ser causados por varios factores, incluidos la inflamación y el traumatismo.2 Una de las características comunes de la inflamación y la pérdida ósea inducida por traumatismos es la activación de la señalización del TNF.18 Para explorar este aspecto, se introdujo TNF-α en el osteoblasto: sistema de cocultivo de osteoclastos para examinar el efecto de la deficiencia de Klotho en la respuesta inflamatoria y la osteoclastogénesis. TNF-α amplificó la diferenciación de osteoclastos inducida por osteoblastos en los grupos de control y mutantes. La osteoclastogénesis se atenuó en osteoblastos cultivados con deficiencia de Klotho en condiciones normales, pero sorprendentemente hubo un aumento aún más significativo del número y la actividad de los osteoclastos en cocultivos de células osteoblásticas con ablación de Klotho tras la administración de TNF-α (Fig. 5a-d). Esto estuvo acompañado por una mayor expresión de Rankl, lo que indica que Klotho puede desempeñar un papel fundamental en la supresión de Rankl inducida por la señalización de TNF-α en los osteoblastos y la posterior formación de osteoclastos durante la inflamación (Fig. 5f). Además, se aplicó ChIP-qPCR para detectar si Klotho podía unirse a la región reguladora indicada de Rankl. El tratamiento de los osteoblastos sobreexpresados con Klotho con TNF-α reveló que Klotho se asoció induciblemente con el elemento regulador distal de Rankl de -140 kB, lo que indica que Klotho puede exhibir una función nuclear para reprimir la transcripción de Rankl bajo inflamación (Fig. 5g).

El análisis GO de genes de mandíbulas con agotamiento de Klotho mostró que los genes regulados al alza estaban asociados con la regulación de la respuesta al estímulo externo, la regulación de la respuesta inflamatoria y la vía de señalización mediada por el factor de necrosis tumoral (Fig. 5h). De hecho, se observaron niveles de expresión más altos del principal receptor de TNF-α, el receptor de TNF I (Tnfr1), en ratones OsxCre;KLfl/fl, con el nivel más alto detectado en ratones OsxCre;KLfl/fl bajo AP. Esta es una indicación adicional de que Klotho puede influir negativamente en la respuesta inflamatoria (Fig. 5i). Para probar esta hipótesis, primero sobreexpresamos Klotho en osteoblastos y encontramos una expresión de TNFR I significativamente suprimida en la citomembrana en condiciones normales (Fig. 5j). El examen de inmunofluorescencia de los osteoblastos de control tratados con TNF-α reveló una mayor expresión de TNFR I en comparación con un grupo tratado con vehículo. Sin embargo, esta regulación positiva se vio atenuada por la sobreexpresión de Klotho (Fig. 5l). Además, la sobreexpresión de Klotho suprimió significativamente la translocalización nuclear de la subunidad NF-κB p65 inducida por TNF-α, lo que resultó en una reducción de los osteoblastos activados al número total de osteoblastos en comparación con las células de control que también se sometieron a TNF-α (Fig. 5k, m ). R-7050 es un inhibidor de TNFR de molécula pequeña que bloquea la asociación de TNFR I con moléculas adaptadoras intracelulares, como TRADD y RIP.19 En particular, la administración de R-7050 evitó la expresión de Rankl inducida por TNF-α y esto ocurrió sin el impacto de la ablación de Klotho, demostrando que Klotho afectó al TNFR I en sí mismo en lugar de a sus moléculas aguas abajo bajo la estimulación con TNF-α (Fig. 5n). Para investigar más a fondo la posibilidad de una interacción entre Klotho y TNFR I, se realizaron ensayos de coinmunoprecipitación. Los resultados indicaron que Klotho podría unirse directamente a TNFR I, lo que puede interferir en la vía de señalización de TNFR I (Fig. 5o).

La expresión de Klotho se ha identificado en una variedad de tejidos humanos, como riñón, placenta, pulmón, páncreas, mama, glándula paratiroides, corazón, vasculatura, cerebro y varios tejidos endocrinos.20 Más recientemente, se ha encontrado expresión de Klotho en tejido óseo en ratones11 y los polimorfismos del gen Klotho se han asociado con cambios en la densidad ósea con el envejecimiento en humanos.21 Pero falta una caracterización detallada de su expresión en el hueso humano. Examinamos la expresión de Klotho en tejido óseo alveolar humano mediante la recolección de muestras de individuos normales y pacientes con AP. La inmunotinción demostró que KLOTHO se expresaba en gran medida en la membrana celular y el citoplasma de los osteoblastos y osteocitos en el hueso alveolar en condiciones fisiológicas normales (Fig. 6b). En estados patológicos, la tinción con H&E mostró que el tejido óseo estaba rodeado de células relacionadas con la inflamación concomitantes con más osteoclastos positivos para TRAP alrededor del tejido óseo (Fig. 6a). Más importante aún, el porcentaje de células positivas para KLOTHO aumentó notablemente con AP, junto con una tendencia hacia una mayor expresión génica (Fig. 6b, c). La transcripción elevada de Klotho también se observó en ratones con AP y extracción dental (Fig. 3 complementaria). Curiosamente, observamos que la expresión de la proteína KLOTHO se localizó en el núcleo celular en pacientes con AP, lo que sugiere una función nuclear potencial para Klotho en condiciones inflamatorias (Fig. 6d).

El hueso alveolar humano en la periodontitis apical se asocia con un patrón de expresión de Klotho alterado. a Tinción H&E y TRAP de individuos sanos y pacientes con AP. b Tinción de inmunofluorescencia y cuantificación de células positivas para KLOTHO en hueso alveolar humano. n = 8 en individuos sanos o 12 en pacientes con AP. c Expresión génica de KLOTHO en hueso alveolar de individuos sanos y pacientes con AP. n = 4 en individuos sanos y n = 7 en pacientes con AP. d Las imágenes 3D obtenidas de la microscopía confocal muestran el patrón de expresión de la proteína KLOTHO. n = 4. El diagrama esquemático mostró que Klotho en progenitores mensenquimales Osx+ ejerce efectos proosteogénicos y antiinflamatorios durante la formación y reparación del hueso mandibular. Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Barra de escala, 100 μm (a), 50 μm (b) y 10 μm (c)

En conjunto, estos resultados demuestran que Klotho en progenitores mensenquimales tiene un papel clave en la formación y reparación del hueso alveolar mandibular al promover directamente la diferenciación osteogénica y regular la osteoclastogénesis de una manera no autónoma de las células. Más importante aún, el Klotho osteoblástico tiene una función central en la supresión de la pérdida ósea inducida por la inflamación (Fig. 6e). El patrón de expresión distinto de Klotho en hueso alveolar humano en condiciones fisiológicas y patológicas normales abre vías para modular la expresión de Klotho en progenitores mensenquimales para estimular la formación y regeneración de hueso alveolar.

Aquí generamos un nuevo modelo de ratón de la eliminación de Klotho específica de Osx que demuestra una función fundamental para Klotho en la regulación de la formación y reparación del hueso alveolar mandibular. Los ratones OsxCre;KLfl/fl exhibieron una formación ósea alveolar reducida durante las etapas de desarrollo y adultas. Además, el análisis de RNA-seq reveló que la expresión génica relacionada con la osteogénesis estaba significativamente regulada a la baja en las mandíbulas mutantes. Esto sugiere que Klotho expresado en células que expresan Osx funciona para estimular la osteogénesis durante la formación de hueso alveolar mandibular. La diferenciación osteogénica alterada en mutantes es similar a la observada en ratones hipomórficos de Klotho, que muestran un número reducido de osteoblastos y osteopenia.22 Hikone et al. encontraron alteración del ligamento periodontal y del hueso alveolar mandibular en ratones kl/kl. Las anormalidades en el hueso alveolar incluyeron un menor número de osteoblastos ALP+ y osteoclastos TRAP+, que fueron similares a los encontrados en ratones OsxCre;KLfl/fl.23 Sin embargo, en ratones kl/kl, el metabolismo mineral gravemente alterado hace que sea difícil medida en que la interrupción de la expresión de Klotho en las células óseas explica el fenotipo esquelético de una manera autónoma celular. De hecho, los tejidos periodontales anormales del tabique interalveolar de los ratones kl/kl podrían rescatarse mediante la administración de una dieta baja en Pi.23 En este estudio, la homeostasis sistémica de iones minerales en ratones OsxCre;KLfl/fl no se vio afectada y esto nos permitió diseccionar el papel específico de tejido de Klotho. El cultivo in vitro de osteoblastos primarios de ratones OsxCre;KLfl/fl y OsxCre confirmó además que la pérdida de Klotho suprime la diferenciación osteogénica, lo que indica un papel autónomo celular de Klotho en la regulación de la formación de hueso alveolar. Además, FGF23 se expresó en osteoblastos, osteocitos, cementoblastos y odontoblastos en las mandíbulas, lo que estuvo altamente correlacionado con el desarrollo de osteoblastos y la mineralización de la matriz.24 La señalización local de Klotho/FGF23 funciona en la mediación de los tejidos periodontales y el desarrollo del hueso alveolar.23,24 En nuestro estudio actual En el estudio, la expresión génica de Fgfr1 y Egr1 en las mandíbulas e iFGF23 fue comparable entre mutantes y compañeros de camada de control (Fig. 1d, e complementaria), lo que sugiere que Klotho puede funcionar de una manera independiente de la señalización de FGF. Además, la ablación de Klotho da como resultado la supresión de la diferenciación de las células progenitoras mesenquimales Osx+ en la respuesta de reparación. La diferenciación osteogénica reducida de los progenitores mensenquimales con deficiencia de Klotho parecía contradictoria con el fenotipo de los ratones con deleción de Klotho específicos de osteocitos, que tienen una actividad osteoblástica regulada al alza y la tasa de formación ósea.11 Nuestra hipótesis es que esta diferencia en los fenotipos óseos informados en ratones con deficiencia de Klotho puede atribuirse a la diferencia en el impacto relativo de la eliminación de Klotho en tipos de células específicos, así como a las distintas características del hueso endocondral frente a la formación de hueso intramembranoso. Por ejemplo, el hueso craneofacial se desarrolla a partir de la migración de células de la cresta neural craneal, que es distinta de la formación de huesos largos.25 Varios factores de crecimiento, receptores y sus vías de señalización aguas abajo tienen diversas funciones en el esqueleto axial y apendicular en comparación con el hueso craneofacial.4 Las diferentes estructuras esqueléticas El fenotipo observado en ratones OsxCre;KLfl/fl destaca el papel específico de Klotho durante la formación del hueso alveolar mandibular. El ejemplo clínico más notable son los pacientes con calcinosis tumoral, una mutación sin sentido homocigótica de Klotho, acompañada de fenotipos orofaciales severos, como osteopenia difusa y esclerosis parcheada en calvarias, así como raíces acortadas.13 Esto último también se observó en OsxCre;KLfl/ fl ratones bajo AP, destacando los mecanismos reguladores distintivos de Klotho a través de diferentes componentes esqueléticos.

Es importante destacar que notamos que la eliminación de Klotho en progenitores mesenquimales Osx + deprimió significativamente la osteoclastogénesis. Observamos una reducción significativa de osteoclastos en ratones OsxCre;KLfl/fl, acompañada de expresión suprimida de marcadores relacionados con osteoclastos. Este fenotipo es similar al de los ratones hipomórficos con Klotho, que exhibieron un número reducido de osteoblastos y osteoclastos y un grosor óseo cortical más bajo. en osteocitos (Dmp1Cre;KLfl/fl), ambos mostraron una tendencia hacia la reducción de los parámetros de reabsorción osteoclástica.11,27

El volumen óseo alveolar general en ratones OsxCre;KLfl/fl aumentó relativamente. Esto se debió a la osteoclastogénesis marcadamente suprimida, que superó la reducción de la osteogénesis. Este desequilibrio en la formación ósea y la resorción ósea finalmente condujo a un volumen óseo alveolar inesperadamente alto en ratones OsxCre;KLfl/fl. Este hallazgo está de acuerdo con varias otras observaciones que mostraron un aumento del volumen óseo trabecular en ratones kl/kl acompañado de un recambio bajo.28 Cabe señalar que a las 3 semanas de edad, la deleción de Klotho no afectó significativamente el volumen óseo alveolar, aunque hubo una disminución en el número de osteoblastos y osteoclastos. Esto podría deberse a la edad temprana de los ratones que analizamos, y el fenotipo se desarrolló con el tiempo a medida que los ratones avanzaban hasta la etapa adulta.

La homeostasis ósea adulta normal se basa en un equilibrio entre la actividad de los osteoblastos y los osteoclastos.29 La función principal de los osteoblastos es depositar matriz ósea, pero también sintetizan y secretan moléculas paracrinas para coordinarse con la osteoclastogénesis.30 Se modula la diferenciación y activación de osteoclastos a partir de su precursor monocítico. en parte por un equilibrio entre Rankl y Opg secretada por los osteoblastos.31 De acuerdo con nuestros resultados, se ha observado una disminución de la expresión de Rankl en ratones OsxCre;KLfl/fl. El cultivo conjunto de osteoblastos y osteoclastos sugiere que los osteoblastos deficientes en Klotho, acompañados de una menor expresión de Rankl, no lograron estimular la osteoclastogénesis in vitro. Esto indica que la resorción ósea disminuida observada en mutantes es el resultado directo de la eliminación funcional de Klotho en progenitores mesenquimales Osx+. Aunque el Klotho específico de los osteoclastos también promovió la osteoclastogénesis inducida por Rankl,26 los ratones OsxCre;KLfl/fl tuvieron una ablación condicional de Klotho en los progenitores Osx+ pero no en los osteoclastos, lo que sugiere que Klotho está involucrado en la resorción ósea dependiente de los osteoblastos, al menos en parte. por la regulación de Rankl en osteoblastos. Se ha sugerido que en las células madre mesenquimales de la médula ósea, la unión de RANKL a RANK activa la señalización de RANKL, que regula negativamente la diferenciación de los osteoblastos. factores relacionados. La expresión de Rankl en células Osx+ en ratones OsxCre;KLfl/fl es esencial para mediar en la osteoclastogénesis.

Otro hallazgo interesante en este estudio es que la resorción ósea se activa en ratones OsxCre;KLfl/fl junto con la pérdida ósea relacionada con la inflamación y la lesión ósea traumática a pesar de la osteoclastogénesis reprimida observada en el estado fisiológico normal. Es notable que el número de osteoclastos y los niveles de Rankl/Opg fueron más altos en ratones Prx1Cre;KLfl/fl durante la inflamación urémica, lo que indica que Klotho en progenitores mesenquimales puede mediar en la osteoclastogénesis en condiciones patológicas. Aunque la periodontitis apical es una patología ósea destructiva y la curación ósea por extracción dental es un proceso regenerativo, ambos implican la regulación de la inflamación. reabsorción ósea.34 El proceso de cicatrización de heridas por extracción dental consta de fases inflamatorias, de reparación y de remodelación, en las que la inflamación es el primer paso fundamental para la cicatrización.35 Ocurre inmediatamente después de la extracción dental en respuesta al trauma y a las agresiones bacterianas.36 Una variedad de citocinas, como TNF-α, interleucina-1, interleucina-6 y motivo de quimiocina 2 (CCL2), se expresan altamente en la etapa inflamatoria.18 En particular, la citocina proinflamatoria TNF-α tiene un papel crucial durante reabsorción ósea y cicatrización ósea. Estimula la osteoclastogénesis al aumentar la producción de Rankl en las células del estroma de la médula ósea, los osteoblastos y los osteocitos.37 El TNF-α activa la señalización celular al unirse a dos tipos de receptores: TNFR I y TNFR II.38 Se cree que el TNFR I media en la mayoría de los procesos biológicos. función del TNF-α y es responsable de la síntesis de Rankl en células de linaje osteo39.

En este estudio, encontramos que la ablación de Klotho en células progenitoras mensenquimales Osx+ regulaba al alza la expresión de TNFR I concomitante con niveles endógenos más altos de expresión de Tnf-α e IL-6 en ratones mutantes versus control. El análisis GO confirmó además la regulación positiva de las vías de inflamación tras la ablación de Klotho. Por otro lado, la sobreexpresión de Klotho en osteoblastos suprimió la expresión de TNFR I tanto a nivel de transcrito como de proteína. Más importante aún, mediante la unión directa de Klotho y TNFR I, Klotho disminuyó la translocación nuclear de NF-κB inducida por la administración de TNF-α y la posterior inducción de la expresión de Rankl, lo que indica las funciones antiinflamatorias de Klotho en células osteoblásticas a nivel celular. Esto puede explicar el aumento de la osteoclastogénesis observado en ratones OsxCre;KLfl/fl en condiciones de periodontitis apical y lesión traumática. La función de Klotho bajo inflamación es fundamental para aplicaciones clínicas, ya que la comunidad microbiana compleja en el entorno oral puede afectar la homestasis y la reparación del hueso alveolar.40 OsxCre se usó para eliminar Klotho en células progenitoras y, por lo tanto, en osteoblastos y osteocitos. La falta de Klotho en esta importante población de células óseas provocó una falla en la inhibición de TNFR I, lo que aceleró la producción de Rankl inducida por la inflamación, lo que finalmente condujo a una resorción ósea regulada al alza. El TNF-α también actúa directamente para aumentar la diferenciación de los macrófagos hacia un destino osteoclástico.41 No podemos excluir la posibilidad de que la presencia de estas células in vivo en el sitio inflamatorio también contribuya a la respuesta de Rankl. Sería interesante determinar si el progenitor mesenquimatoso-Klotho tiene un papel regulador indirecto en las células inmunes en estudios futuros.

La función antiinflamatoria de Klotho se ha informado previamente en otros lugares, como riñón, endotelio, páncreas y sangre periférica.42,43 Los ratones que carecen de Klotho presentan un mayor daño inflamatorio en animales con enfermedades renales.44 Por el contrario, la suplementación exógena de Klotho Klotho o la expresión transgénica de Klotho puede rescatar estos procesos patológicos renales asociados a la inflamación.45 Además, Klotho disminuyó la respuesta inflamatoria al lipopolisacárido en los monocitos.46 En las células endoteliales, Klotho podría estar asociado con el proceso inflamatorio al atenuar las moléculas de adhesión y la expresión de NF-κB. .43 Estas observaciones se atribuyen principalmente a la función de la forma soluble de Klotho, generada a partir del empalme alternativo o del desprendimiento del ectodominio de Klotho unido a la membrana.47 En conjunto con nuestro estudio, existe una interacción importante entre la respuesta inflamatoria de Klotho posiblemente mediada por retroalimentación negativa sobre el TNFR I. Si el tipo de proteína Klotho unida a la membrana o soluble es dominante en este efecto, merece una mayor investigación.

Nuestra comprensión básica del patrón de expresión celular de Klotho en tejidos humanos permanece en gran parte inexplorada. Estudios previos han detectado Klotho tanto citoplasmático como unido a la membrana mediante tinción de inmunofluorescencia de riñón humano, glándula paratiroides, sangre periférica, monocitos peritoneales, cardiomiocitos, tejidos de cáncer de colon y varias células derivadas de tejido humano.48 Mostramos aquí por primera vez, la presencia de expresión génica y proteica de Klotho endógeno en tejido óseo humano. Su expresión está restringida a la membrana celular y el citoplasma en osteoblastos y osteocitos, lo que está de acuerdo con su patrón de expresión general. Estudios limitados han mencionado la función nuclear de Klotho. Alemán et al. encontraron abundante Klotho cerca de la membrana nuclear en las células del plexo coroideo y las células de Purkinje en el cerebro.49 Cabe destacar que en nuestro estudio observamos que Klotho puede tener una función nuclear en respuesta a estímulos externos como la inflamación. Varias líneas de evidencia apoyan este principio. Primero, el patrón de expresión de Klotho se alteró dramáticamente en pacientes con periodontitis apical. La proteína Klotho se desplazó hacia el núcleo, acompañada de una mayor transcripción del gen Klotho tanto en humanos como en ratones en presencia de la enfermedad. La regulación al alza de la expresión de Klotho en el hueso alveolar durante condiciones patológicas podría tener un efecto protector al inhibir la resorción ósea relacionada con la inflamación. En segundo lugar, el ensayo ChIP confirmó que Klotho fue inducido por TNF-α para una translocalización nuclear y se unió al elemento regulador distal de Rankl. Además, aunque R-7050 bloqueó la estimulación de Rankl por TNF-α, se detectó una mayor expresión de Rankl en los osteoblastos ablacionados con Klotho en comparación con las células de control bajo tratamiento con TNF-α y R-7050, lo que enfatiza la función nuclear observada de Klotho en la supresión. Rankl. Estos datos destacaron el papel potencial de Klotho más allá de su función regonizada anterior como proteína unida a la membrana.

En conclusión, hemos demostrado que la eliminación específica de Klotho en progenitores mensenquimales Osx+ disminuye la formación de hueso alveolar mandibular y la reabsorción ósea, lo que lleva a un aumento de la masa ósea alveolar. Encontramos que los osteoblastos deficientes en Klotho expresan menos Rankl, que es responsable de suprimir la osteoclastogénesis. Además, la formación ósea durante la reparación ósea relacionada con la inflamación se atenúa en los osteoblastos deficientes en Klotho. Curiosamente, Klotho se activa durante la remodelación del hueso alveolar en ratones y humanos, donde funciona para inhibir la expresión de Rankl inducida por TNF-α en células de linaje de osteoblastos y mediar indirectamente en la formación de osteoclastos. Estos hallazgos revelan nuevas funciones fisiológicas y patológicas de Klotho expresado en progenitores mesenquimales en la mediación del desarrollo y la reparación del hueso alveolar mandibular.

Todos los experimentos con animales se realizaron con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Orales, Universidad de Sichuan. Las muestras quirúrgicas periapicales humanas se recolectaron cuando todos los pacientes firmaron un formulario de consentimiento informado para participar en el estudio y para el uso de sus tejidos biológicos. El estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Estomatología de China Occidental, Universidad de Sichuan.

Los ratones Floxed Klotho y OsxCre se describieron previamente. Se adquirieron 50 ratones B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J de Jackson Laboratory. Se generaron ratones con un knockout condicional de Klotho utilizando el sistema de recombinación Cre-LoxP. Se aparearon ratones KLfl/fl con ratones OsxCre para generar ratones OsxCre;KLfl/+. Luego, los ratones machos OsxCre;KLfl/+ se cruzaron con hembras KLfl/+ para obtener ratones OsxCre (control) y OsxCre;KLfl/fl (mutantes).

Se recolectaron especímenes óseos de lesiones periapicales humanas durante la cirugía endodóntica para su uso como grupo apical periapical (AP). Se recogieron muestras de hueso de control de una región normal de hueso alveolar durante la osteotomía mandibular. Se recogieron muestras para extracción de ARN total y examen histológico.

Los ratones P0 fueron desollados y fijados en etanol al 95%. Se realizaron tinciones con rojo alizarina S y azul alcián para análisis de cartílago y tejidos mineralizados. Las mandíbulas y los maxilares de ratones de 3 y 11 semanas de edad se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche y luego se almacenaron en etanol al 70 % a 4 °C antes del procesamiento. Las muestras se escanearon utilizando el escáner μCT (μCT50, Scanco, Suiza), operado a 50 kV, 200 μA, con un tiempo de exposición de 300 ms y una resolución de 7,0 μm por píxel. Las imágenes fueron reconstruidas en forma tridimensional. Las regiones de interés se seleccionaron de la furca de la raíz del primer molar mandibular en hueso alveolar normal, 1/3 del nivel del ápice de la raíz en un modelo de periodontitis apical y la cavidad de la raíz mesial del primer molar superior en un modelo de extracción dental. Se midieron parámetros relacionados con el hueso para analizar la calidad del hueso alveolar y el área de la lesión.

Las muestras fijadas se descalcificaron en EDTA al 20% (pH 7,5), se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm utilizando un micrótomo HM360 (Microm). Se realizó tinción con hematoxilina (VWR) y eosina (Sigma-Aldrich) para evaluar la histomorfología. Se utilizó fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) (Sigma) para detectar osteoclastos según los protocolos de los fabricantes. Para la tinción de inmunofluorescencia, los portaobjetos se sometieron a tampón de citrato de sodio a 95 °C durante 20 min para la recuperación del antígeno, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (Beyotime) durante 10 min y se bloquearon con BSA al 5 % durante 1 h. Los portaobjetos se incubaron con Anti-Runx2 (1:200, Abcam, ab23981), Anti-GFP (1:50, Santa Cruz, sc-9996), Anti-RFP (1:50, Santa Cruz, sc-390909), Anti -Klotho (1:100, R&D, AF1819), Anti-Klotho (1:100, Santa Cruz, sc-515939) o Anti-Rankl (1:100, R&D, AF462) anticuerpo durante la noche a 4 °C, y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, Alexa Fluor 488 o 568 (Invitrogen, 1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los núcleos se contrastaron con DAPI (Vector). Las imágenes fueron capturadas en un microscopio confocal Olympus FV3000 (Olympus).

Se usaron mandíbulas de ratones control y mutantes en el día postnatal 21 (P21) para extraer el ARN total y analizar con RNA-seq. Las bibliotecas de secuenciación se generaron con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext® UltraTM para Illumina® (NEB, EE. UU.) y se agregaron códigos de índice para correlacionar las secuencias con cada muestra. Las preparaciones de la biblioteca se secuenciaron en una plataforma Illumina Hiseq.

Se usaron ratones de ocho semanas de edad para crear modelos de periodontitis apical y extracción de dientes como se describió anteriormente. Los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Para el modelo de periodontitis apical, se abrió el primer molar mandibular derecho utilizando una pieza de mano de alta velocidad. Los conductos radiculares se sondaron con una lima K endodóntica #10 bajo un estereomicroscopio (Leica). La cámara pulpar se expuso a la cavidad bucal durante 3 semanas. Los primeros molares contralaterales se usaron como control. El modelo de extracción dental se creó utilizando los primeros molares superiores derechos, que se extrajeron con agujas de jeringa de 26 G y fórceps bajo el microscopio estereoscópico. Se aplicó una presión suave para detener el sangrado. Los ratones se alimentaron con una dieta de alimentos blandos durante 3 semanas después de la cirugía y se sacrificaron.

Las células MC3T3 que sobreexpresan Klotho se cultivaron en placas de 100 mm y se homogeneizaron mediante un ensayo de lisis de células completas (KeyGEN). La concentración de proteínas se midió mediante un kit de ensayo de proteínas BCA mejorado (Beyotime). La inmunoprecipitación se realizó mediante el reactivo de inmunoprecipitación de proteína A/G PLUS-Agarosa (Santa Cruz, sc-2003) de acuerdo con las directrices del fabricante. Luego, las muestras se degeneraron a 70 °C con el tampón de muestra NuPAGE LDS y el agente reductor NuPAGE (Life Technologies), se separaron con NuPAGE 4–12 % Bis-Tris SDS/PAGE usando geles prefabricados (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore) . Después de 1 h de bloqueo, las membranas se incubaron con anticuerpo anti-KLOTHO (1:1000, Cosmo Bio, KM2076) o anticuerpo anti-TNFR I (1:1000, Abcam, ab223352) durante la noche. Se usaron anticuerpos secundarios IgG de cabra anti-rata/conejo conjugados con HRP (1:5000, Signalway Antibody, L3012 y L35027) y se detectaron mediante un kit de quimioluminiscencia mejorado (Bio-Rad Laboratories).

Todos los datos se expresan como media ± SEM. Para el análisis estadístico, se utilizó GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc.). Las comparaciones de dos grupos se evaluaron mediante pruebas t de Student de dos colas no pareadas, y las comparaciones múltiples se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) o ANOVA bidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos para todos los análisis.

Los métodos extendidos y la información sobre el doble etiquetado de calceína, las mediciones de suero, el cultivo de células, la transfección, la inmunocitoquímica, el aislamiento de ARN y los análisis qRT-PCR, el ensayo ChIP se describen en Materiales y métodos complementarios.

Los conjuntos de datos para el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NSFC 81800928, 81901040 y 82171001, el Programa de patrocinio de jóvenes científicos de élite de CAST (No. 2020QNRC001 y 2018QNR001), el Programa de ciencia y tecnología de Sichuan (No. 2019YJ0054), Financiamiento de investigación de West China School/Hospital de Estomatología de la Universidad de Sichuan (No. RCDWJS2021-1), State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding Grant SKLOD202114.

Estos autores contribuyeron por igual: Yi Fan, Chen Cui.

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Yi Fan, Chen Cui y Ruoshi Xu

Hospital de Estomatología, Escuela de Estomatología de Guanghua, Universidad Sun Yat-Sen, Laboratorio Provincial Clave de Estomatología de Guangdong, 510055, Guangzhou, Guangdong, China

Chen Cui y Xi Wei

Instituto de Investigación del Centro Médico de Maine, Scarborough, ME, 04074, EE. UU.

Clifford J. Rosen

Unidad Endocrina, Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, 02215, EE. UU.

tadatoshi sato

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthognathic and TMJ Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Peiran Li y Ruiye Bi

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral Implantology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Quan Yuan

Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Bucales, Centro Nacional de Investigación Clínica para Enfermedades Bucales, Departamento de Ortodoncia, Hospital de Estomatología de China Occidental, Universidad de Sichuan, 610041, Chengdu, Sichuan, China

Chenchen Zhou

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CZ, QY y YF concibieron el estudio y diseñaron todos los experimentos. YF, CC, CZ, QY y CJR escribieron el manuscrito. YF, CC, ST, RX, PL, XW y RB realizaron los experimentos y analizaron los datos. Todos los autores han leído y aprobado el artículo.

Correspondencia a Quan Yuan o Chenchen Zhou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

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Recibido: 13 diciembre 2021

Revisado: 03 de marzo de 2022

Aceptado: 06 marzo 2022

Publicado: 11 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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