Base estructural para la regulación de lípidos y cobre del transportador ABC MsbA

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 7291 (2022) Citar este artículo

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Un paso crítico en la biogénesis de los lipopolisacáridos (LPS) consiste en voltear el lipooligosacárido, un precursor de LPS, del citoplasma al velo periplásmico de la membrana interna, una operación llevada a cabo por el transportador de casete de unión a ATP MsbA. Aunque la unión de LPS a la cavidad interna de MsbA está bien establecida, la selectividad de las interacciones MsbA-lípidos en otro(s) sitio(s) sigue siendo poco conocida. Aquí usamos espectrometría de masas nativa (MS) para caracterizar las interacciones MsbA-lípidos y guiar los estudios estructurales. Mostramos que el transportador co-purifica con cobre (II) y la unión de metales modula las interacciones proteína-lípido. Se presenta una estructura de resolución de 2,15 Å de una región N-terminal de MsbA en complejo con cobre (II), que revela una estructura que recuerda al péptido GHK, un quelante de cobre (II) de alta afinidad. Nuestros resultados demuestran afinidades de unión a lípidos dependientes de la conformación, particularmente para el precursor de LPS, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico (Kdo) 2-lípido A (KDL). Presentamos una estructura de resolución de 3,6 Å de MsbA atrapada en una conformación abierta orientada hacia el exterior con adenosina 5'-difosfato y vanadato, que revela un sitio de unión de KDL distinto, en el que el lípido forma amplias interacciones con el transportador. Estudios adicionales proporcionan evidencia de que el sitio de unión exterior de KDL está conservado y es un modulador alostérico positivo de la actividad ATPasa, que sirve como un mecanismo de activación de avance para acoplar la actividad del transportador con la biosíntesis de LPS.

Una característica definitoria de la mayoría de las bacterias Gram-negativas es la presencia de lipopolisacárido (LPS) en la hoja externa de la membrana externa1,2,3. LPS contribuye a la formación de una barrera impermeable que ayuda a las bacterias a resistir los antibióticos y el estrés ambiental2. La biogénesis de LPS comienza en el citoplasma con la producción del lipooligosacárido (LOS) precursor de LPS seguido de un transporte orquestado a la superficie celular junto con otras modificaciones (Fig. 1a)4. LOS contiene un resto de lípido A conservado, un disacárido bifosforilado de glucosamina (GlcN) con cuatro a siete cadenas de acilo, que está decorado con azúcar de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico (Kdo)1. La decoración adicional incluye la unión de un oligosacárido central, que varía en diferentes bacterias2. El LOS citoplasmático se voltea desde el interior hacia el velo periplásmico de la membrana interna, un paso esencial llevado a cabo por el transportador MsbA del casete de unión a ATP (ABC). Dado que la inhibición o eliminación de MsbA es letal5, el transportador se ha convertido en un objetivo atractivo para el desarrollo de antibióticos. Recientemente se han desarrollado inhibidores de MsbA de molécula pequeña que varían en el modo de acción, como atrapar el transportador en una conformación orientada hacia adentro (IF) o imitar la unión al sustrato6,7,8,9,10.

a La biosíntesis de lipopolisacáridos comienza en el citoplasma para generar lipooligosacáridos (LOS). LOS está compuesto por una estructura de lípido A conservada (gris), un disacárido bifosforilado de glucosamina, modificado con azúcar (naranja) y oligosacárido central (púrpura), del cual depende de las bacterias. MsbA, impulsado por la hidrólisis de ATP, voltea LOS citoplásmicos de la hoja interna a la externa de la membrana interna, un paso esencial en la biogénesis de LPS. El LOS invertido se transporta a la membrana exterior junto con modificaciones adicionales para convertirse en LPS. b El espectro de masas nativo de muestras optimizadas de MsbA en C10E5 produce un espectro de masas bien resuelto. c Constantes de disociación de equilibrio (KD) para eventos de unión de lípidos individuales a MsbA parcialmente cargado. d Deconvolución del espectro de masas que se muestra en el panel b. Las diferentes especies moleculares corresponden a MsbA dimérico y diferentes números de iones de cobre unidos. e La masa medida de MsbA después de la carga con cobre (II) muestra la saturación de dos sitios de unión. f KD para eventos de unión de lípidos individuales a MsbA completamente cargado con cobre (II). Se informan la media y la desviación estándar (n = 3, réplicas biológicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Una serie de estudios que emplean un arsenal de técnicas biofísicas han proporcionado información mecánica y estructural sobre MsbA6,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. MsbA forma un homodímero, cada subunidad consta de un dominio transmembrana (TMD, seis hélices transmembrana por subunidad) y un dominio de unión a nucleótidos expuesto al citosol (NBD)21. El mecanismo propuesto por el cual MsbA transloca LOS a través de la bicapa involucra varios pasos6,17. La MsbA unida a apo o adenosina 5'-difosfato (ADP) puebla una conformación IF con los NBD separados en el espacio, promoviendo la entrada y unión del voluminoso LOS. La unión de LOS en la cavidad interior central y la adenosina 5'-trifosfato (ATP) a MsbA promueve la dimerización de los NBD. La hidrólisis de ATP impulsa un cambio conformacional a una conformación orientada hacia afuera (OF), transportando LOS al lado periplásmico de la membrana interna. LOS y el fosfato inorgánico se liberan y MsbA regresa a una conformación IF. Como muchos otros transportadores ABC, la actividad ATPasa de MsbA se estimula en presencia de diferentes sustratos, particularmente especies de lípido A hexaacilado, como el ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico (Kdo)2-lípido A ( KDL)22,23,24. Aunque el reconocimiento altamente selectivo de LPS en la cavidad interna por parte de MsbA es bien entendido6,17, la base estructural de la estimulación de la actividad ATPasa de MsbA para la unión de lípidos a otro(s) sitio(s) sigue sin entenderse bien.

La espectrometría de masas (MS) nativa se ha convertido en una técnica biofísica indispensable para estudiar los complejos de proteínas de membrana y sus interacciones con los lípidos y otras moléculas25. Con la capacidad de preservar las interacciones no covalentes y la estructura similar a la nativa de las proteínas de membrana en la fase gaseosa26,27, la técnica ha proporcionado información detallada sobre diversas interacciones bioquímicas, incluida la unión de nucleótidos, fármacos, péptidos y lípidos, así como datos termodinámicos para interacciones proteína-proteína, proteína-ligando y proteína-lípido28,29,30,31,32,33,34,35. En este estudio, nos propusimos caracterizar las interacciones MsbA-lípidos en diferentes estados conformacionales: apo, hacia adentro; y vanadato atrapado, orientado hacia el exterior. Los estudios nativos de MS revelan que MsbA se copurifica con cobre (II), pero también las interacciones MsbA-lípidos están directamente influenciadas por la unión de metales y la conformación de proteínas. Los estudios estructurales revelan un sitio de unión a KDL que no se había observado previamente en otras estructuras ABC. Nuestros hallazgos aportan nuevos conocimientos sobre la regulación de metales y lípidos de MsbA.

Como se informó que MsbA se copurifica con LPS y otros lípidos17,36, nuestro primer objetivo fue optimizar la purificación de MsbA de E. coli para estudios nativos de EM. El espectro de masas de MsbA purificado en el detergente n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM) era una joroba ancha (Figura 1 complementaria), lo que indica una muestra muy heterogénea, correspondiente a una batería de contaminantes de molécula pequeña copurificados. Los agudos picos espectrales de masas que decoran la joroba subyacente, centrados alrededor de 4500 m/z, corresponden a MsbA monomérico, resultante de la disociación del homodímero bajo condiciones no nativas de alta activación. Después de emplear un método de detección de detergente establecido para optimizar la purificación de proteínas (consulte la Nota complementaria 1) 37, las muestras de MsbA solubilizadas en el detergente de éter monodecílico de pentaetilenglicol (C10E5) exhibieron un espectro de masas bien resuelto (Fig. 1b). Las muestras de MsbA también hidrolizaron ATP con el tiempo, como lo demuestra la presencia de ADP, mientras que MsbA que contenía la mutación E506Q, que anula la actividad catalítica38, no transformó ATP (Fig. 1c-d complementaria). Curiosamente, se miden diferentes especies moleculares, correspondientes a MsbA dimérico y la adición de uno a tres aductos de ~ 65 Da (Fig. 1d y Tabla complementaria 1). El análisis de muestras de MsbA utilizando espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) identificó los aductos unidos como cobre (Tablas complementarias 2-3). La adición de cobre (II) a MsbA saturó los dos sitios de unión (Fig. 1e). La eliminación del exceso de cobre (II) ni la adición del quelante de cobre (II), trientina 39, redujeron la cantidad de metal unido a MsbA (Fig. 2 complementaria). Estos resultados revelan que MsbA tiene un sitio de unión de cobre (II) de alta afinidad por subunidad.

Para comprender mejor las interacciones MsbA-lípidos, determinamos las constantes de unión de equilibrio para la unión de MsbA a diferentes lípidos. Para estos estudios, seleccionamos 1,1′,2,2′-tetraoleoil-cardiolipina (TOCDL, 72:4) o ácido fosfatídico (PA), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilserina (PS) que contiene la composición de la cadena de acilo, 1-palmitoil-2-oleoil (PO, 16:0-18:1). También incluimos ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico (Kdo)2-lípido A (KDL), un precursor de LPS conocido por estimular la actividad ATPasa de MsbA22,23,24. Excepto PC, estos lípidos se encuentran en E. coli40. MsbA parcial y totalmente cargado con cobre (II) se tituló con cada lípido y luego se registraron sus espectros de masas nativos (Figs. 3-6 complementarias). Las fracciones molares de apo y estados unidos a lípidos de MsbA se extrajeron de los datos de MS desconvolucionados y se usaron para determinar la constante de disociación de equilibrio (KDN) para el evento de unión Nth (Tablas complementarias 4-5). MsbA cargado con cobre (II) dio como resultado una mejora estadísticamente significativa en las afinidades de unión para POPA y POPS (Fig. 1c-f y Fig. 7 complementaria). Los dos lípidos de unión más fuerte para MsbA cargado con cobre (II) fueron TOCDL (KD1 = 1,6 µM) y KDL (KD1 = 0,6 µM). Las afinidades de unión a POPG fueron en gran medida independientes del estado unido al cobre (II) de MsbA. En resumen, estos resultados demuestran que MsbA no solo se une selectivamente a los lípidos sino que también depende del grado de cobre (II) unido al transportador.

Se han informado previamente dos sitios de unión a metales putativos para una MsbA41. La mutación de uno de los sitios putativos (H562A y H576A) no eliminó la unión de cobre (II) (Fig. 2 complementaria). Después de inspeccionar cuidadosamente las estructuras de MsbA centrándonos en los residuos de histidina y cisteína, los cuales se sabe que coordinan preferentemente el cobre42, notamos que en todas las estructuras de MsbA no se observa la histidina N-terminal, lo que probablemente se deba a un conector flexible o a que puebla diferentes estructuras La eliminación de los primeros cuatro residuos (Met-His-Asn-Asp) de MsbA eliminó la unión de cobre (II) (Fig. 2a), fijando el sitio de unión del metal al extremo N-terminal. Estudios adicionales muestran que la proteína libre de cobre (II) truncada no muestra una actividad de ATPasa alterada en el detergente ni en los proteoliposomas (Figura 8 complementaria). Como se ha demostrado que la Met iniciadora se elimina de algunas proteínas bacterianas43, expresamos y purificamos MsbA con una etiqueta de afinidad C-terminal y descubrimos que conserva un extremo N intacto que también puede unirse al cobre (II) (Figura complementaria 2). Curiosamente, las simulaciones de MD44 muestran que el extremo N de MsbA en diferentes estructuras está ubicado cerca de la membrana interna y en una región donde LOS podría pasar antes de ingresar a la cavidad interior (Fig. 2b y Figura complementaria 9).

un espectro de masas nativo y desconvolución de MsbA con eliminación de cuatro residuos N-terminales. No hay cobre (II) unido al transportador truncado. b Instantánea de una simulación de dinámica molecular de MsbA en una bicapa de PC 16:0 (DPPC) (PDB 6BPP descargado de MemProtMD44). DPPC se muestra en representación de barra (gris). La proteína se muestra en una representación de dibujos animados con los residuos 4-8 de color rosa. El cuadro amarillo resalta la ubicación del extremo N en relación con la membrana interna. c Estructura del extremo N de MsbA (residuos 1-4) fusionada con la proteína fluorescente verde (GFP) que coordina el cobre (II). El péptido N-terminal se muestra en representación de barra con agua (azul) y cobre (II) como esferas. Los bonos se muestran como líneas discontinuas (limón). Pico de diferencia anómalo mostrado en magenta y contorneado en 15 sigma. La estructura de GFP se omite para mayor claridad. d Alineación del péptido MsbA N-terminal unido al cobre (II) con el complejo GHK-cobre (II) (CCDC-809108, Cα de color púrpura).

Para facilitar la determinación de la estructura, la secuencia N-terminal de MsbA se injertó en proteínas que se sabe que cristalizan fácilmente. La MS nativa muestra estas proteínas de fusión que contienen un fragmento del extremo N de MsbA de cobre (II) unido de longitud variable y monomérico (Fig. 10 complementaria). Una de las fusiones de proteína fluorescente verde (GFP), que contenía los residuos 1-4 de MsbA, produjo cristales de grado de rayos X que condujeron a la determinación de la estructura a una resolución de 2,15 Å (Tabla complementaria 6). La densidad de electrones resuelta para el extremo N se observa junto con una fuerte señal anómala para el ion de cobre unido (Fig. 2c y Fig. 11 complementaria) y adopta una estructura similar a la del péptido GHK coordinado con cobre (II), un péptido naturalmente quelante de cobre (II) de alta afinidad que se encuentra en el plasma sanguíneo (Fig. 2d)45. El cobre(II) adopta una coordinación pseudo-octaédrica con los ligandos planos compuestos por la amina de M1, la amida y la cadena lateral de H2. Una interacción adicional está formada por la cadena lateral de D197 'de una molécula relacionada con la simetría (Fig. 10c complementaria) y similar a la estructura GHK-cobre (II), en la que es un carboxilato C-terminal. Los ligandos axiales del cobre (II) son agua, uno de los cuales forma un puente entre el cobre y la cadena lateral y la amida de N3. Esta interacción representa un contacto cristalino y la coordinación difiere del péptido GHK en las aguas axiales y el N3 participa en un puente de agua hacia el ion metálico (Fig. 2d)46. La diferencia entre las dos estructuras sugiere que la tercera posición puede ser variable. Dada la proximidad del N-terminal a la hoja interna (Fig. 2b y Fig. 11 complementaria), la estructura unida al cobre (II) podría involucrar al grupo de cabeza de lípidos, lo que resulta en una mayor afinidad de unión a lípidos. El análisis de las secuencias del transportador ABC revela que más de 400 proteínas contienen una histidina en la segunda posición, incluidas algunas con una secuencia N-terminal de MHK, y pueden tener relevancia para otros transportadores ABC.

Para determinar el impacto de la conformación de MsbA en la afinidad de unión a lípidos, se realizaron experimentos análogos usando MsbA atrapada en una conformación OF abierta con adenosina difosfato (ADP) y vanadato (VO4). La medición de masa nativa muestra que cada subunidad del transportador está unida a moléculas de cobre (II), ADP y VO4 (Fig. 3a y Tabla complementaria 1). Las constantes de disociación revelaron que MsbA en la conformación OF abierta mostró una mayor afinidad de unión a lípidos para un subconjunto de lípidos (Fig. 3d y Fig. 12-14 complementaria, y Tabla complementaria 7). Por ejemplo, en presencia de 0,4 μM de KDL, la MsbA atrapada con vanadato se une a dos lípidos, mientras que la proteína no atrapada se une solo a una KDL (Fig. 3b-c). En particular, la afinidad de unión por KDL (KD1 = 0,3 µM) aumentó significativamente dos veces en comparación con la proteína no atrapada (Fig. 3d). Curiosamente, el cambio en KD para cada evento de unión a lípidos posterior se redujo significativamente, una indicación de una fuerte cooperatividad positiva. La unión de POPC y POPE recuerda a la de MsbA parcialmente cargada con cobre (II). POPA y POPG mostraron un modesto aumento general en la afinidad de unión. Juntos, estos resultados demuestran que diferentes estados conformacionales de MsbA se unen a lípidos con diferentes afinidades.

un espectro de masas representativo de MsbA atrapada con ADP·VO4 y en presencia de 0,4 μM KDL. b Desconvolución del espectro de masas que se muestra en el panel a. c Espectro de masa desconvolucionado de MsbA no atrapada en presencia de la misma cantidad de KDL. Se observa una reducción significativa en la unión de KDL a MsbA. d Valores de KD para eventos de unión de lípidos individuales a MsbA atrapada con ADP y vanadato. Se informan la media y la desviación estándar (n=3, réplicas biológicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como KDL se une a MsbA unido a cobre (II) con una afinidad mayor que los otros lípidos, preparamos MsbA atrapada con ADP y vanadato (62 µM) en presencia de un exceso molar doble de KDL (124 µM) en C10E5 para crio -estudios de microscopía electrónica (crioEM). La estructura del complejo se determinó con una resolución de 3.6 Å (Fig. 4a, Figs. 15–16 complementarias, Tabla complementaria 8 y Nota complementaria 2). La estructura es similar a la de la MsbA atrapada con vanadato de S. typhimurium, pero difiere de las estructuras de MsbA ocluidas atrapadas con vanadato informadas anteriormente17,47, en gran parte en el TMD (Fig. 17 complementaria). Se observa una densidad adicional centrada en TM5 en una región dentro de la hoja citoplásmica de la membrana interna, en la que KDL podría modelarse directamente en esta densidad (Fig. 4a). La ubicación de KDL es diferente del sitio de unión interior6,17 y el supuesto sitio de unión exterior19 ubicado en el lado opuesto de la membrana interna (Fig. 5). La superficie electrostática de MsbA muestra que el grupo de cabeza de KDL está unido a un parche básico grande (Fig. 4b). Se podrían modelar cadenas de acilo de KDL, que interactúan con la superficie hidrofóbica de MsbA (Fig. 4c). Se forman amplias interacciones entre KDL y MsbA con un área de interfaz de 2779 Å2. Los sustituyentes característicos de fosfoglucosamina (P-GlcN) de LOS están coordinados por R238 en un lado y R188 y K243 en el otro lado (Fig. 4d). Además, R236, Q240 y K243 interactúan con uno de los grupos Kdo de LOS (Fig. 4d). También observamos que la concentración de KDL utilizada aquí es mucho menor que la utilizada para las estructuras de MsbA unida a G907 o TBT1, en las que se utilizaron 1 mM y 400 µM del fármaco respectivo6,8. Esto fortalece aún más la unión específica de KDL al sitio exterior. Además, existe una clara densidad de ADP · VO4 en los NBD, coordinada por una red de residuos conservados (Fig. 4e y Fig. 18 complementaria). En resumen, el sitio de unión de KDL exterior identificado aquí puede tener un papel en la regulación de la función MsbA.

una reconstrucción Cryo-EM (3,6 Å) de MsbA(ADP·VO4) en complejo con KDL. La densidad de KDL se muestra en amarillo y las subunidades MsbA se muestran en rosa y azul. b El potencial electrostático coulombiano (barra de escala −10 a +10 calculada por ChimeraX62) está coloreado en rojo y azul para cargas negativas y positivas, respectivamente. KDL y los residuos que interactúan se muestran en representación de bola y palo. c MsbA mostrado con superficies hidrofílicas e hidrofóbicas de color azul y dorado, respectivamente. d Distintas vistas de KDL vinculadas a MsbA. KDL y los residuos que interactúan se muestran en representación de barra. Los bonos se muestran como líneas discontinuas amarillas. Los residuos están etiquetados. e Vista del ADP·VO4 unido y los residuos que interactúan mostrados como se describe en d.

Las estructuras se muestran en representación de dibujos animados con lípidos (si están presentes) mostrados en esferas naranjas. Se muestran dos vistas (0 y 90°). Se muestra el sitio de unión exterior a (este trabajo), el sitio de unión interior b (PDB 6BPL)6,17 y el sitio de unión exterior putativo c (PDB 6BL6)19,64. En el panel c, la densidad no fue lo suficientemente clara para modelar el lípido y el sitio putativo se indica con un círculo rojo19. d Logotipo de secuencia de residuos que interactúan con KDL (83, 87, 188, 236, 238, 240 y 243) basado en una alineación de 258 secuencias de MsbA de toda la filogenia bacteriana.

El sitio de unión único de KDL descubierto aquí revela una característica conservada evolutivamente de MsbA. Los residuos (R188, R238 y K243) que interactúan con los sustituyentes P-GlcN característicos de LOS están conservados (Fig. 5d). Se han observado interacciones similares para el sitio LOS interior en MsbA6,17 y el reconocimiento de LPS en LptB2FG, un transportador LPS ABC48. También se conservan otros residuos (R236 y Q240) que coordinan un grupo Kdo de KDL (Fig. 5d). Como la mayoría de los LOS de las bacterias gramnegativas sintetizan una molécula de KDL similar a las que se encuentran en E. coli3, la conservación de los residuos y su interacción con KDL establecen esto como una característica única de MsbA en comparación con otros transportadores. Además, el gran parche básico que alberga el grupo de cabeza KDL se extiende más allá de los grupos Kdo que podrían unirse aún más al oligosacárido central de LOS, el glicolípido MsbA voltea. Este parche básico probablemente se extiende a otros MsbA y es importante para el reconocimiento de LOS, incluidos otros lípidos, que varían en estructura en diferentes bacterias2.

Se evaluó una serie de mutantes de MsbA diseñados para afectar la unión de KDL. Algunas de las proteínas mutantes de MsbA se pudieron expresar y purificar, pero eran bioquímicamente inestables cuando se observó el truncamiento del transportador después del tratamiento con vanadato, como MsbAY87F,R238A (Figura 19 complementaria). MsbA que contenía las mutaciones R188A y K243A (MsbAR188A, K243A), diseñado para interrumpir la interacción con uno de los sustituyentes P-GlcN de KDL, era bioquímicamente estable y adecuado para determinar KD (Fig. 6a-c y Fig. 20 complementaria). Para la proteína no atrapada, KD1 aumentó dos veces y KD2 aumentó cinco veces. En el estado atrapado, KD1 y KD2 también aumentaron estadísticamente en más del doble. Como se sabe que MsbA es estimulada por algunos lípidos22,23,24,49, determinamos la actividad ATPasa de MsbA en ausencia y presencia de lípidos (Fig. 6d). KDL estimuló MsbA de tipo salvaje a niveles observados por otros17,22. Sin embargo, RaLPS (LRa), un LOS con un núcleo50 tipo E. coli R2 completo, estimuló la actividad ATPasa de MsbA en mayor grado (Fig. 6d)22. De acuerdo con un informe anterior22, el lípido A (LA), similar a KDL pero que carece de los sustituyentes Kdo, estimuló MsbA pero en menor medida, destacando la importancia de los grupos Kdo. MsbAR188A, K243A mostró una disminución estadísticamente significativa en la estimulación que fue independiente del tipo de lípido (Fig. 6d). También se evaluó la estimulación inducida por lípidos de MsbA que contiene mutaciones R78A y K299A (MsbAR78A, K299A), diseñada para interrumpir la unión en el sitio interior (Fig. 5b). MsbAR78A, K299A no mostró estimulación por LA y KDL, pero LRa estimuló la actividad al mismo nivel que la proteína de tipo salvaje (Fig. 6d). A continuación, inspeccionamos los residuos que coordinan KDL en estructuras MsbA (Fig. 6e y Fig. 21 complementaria). Excepto por R188, los residuos que interactúan con KDL están en posiciones similares. Sin embargo, en los estados OF (ocluidos y abiertos), TM4 se desplaza ~12 Å en una dirección hacia los otros residuos, lo que prepara a R188 para que se una a la P-GlcN de KDL. Esta interacción adicional explica la mejora en la afinidad de unión a KDL. Juntos, estos resultados indican que el sitio de unión de KDL exterior tiene un papel directo en la estimulación alostérica de la actividad ATPasa de MsbA.

un espectro de masas desconvolucionado de MsbAR188A,K243A 0,3 μM en presencia de KDL 0,4 μM. b Espectro de masa desconvolucionado de MsbAR188A,K243A atrapada con vanadato 0,4 μM con la misma concentración de KDL que en el panel a. c Valores de KD para la unión de KDL al MsbA de tipo salvaje y mutante. d Actividad ATPasa de MsbA, MsbAR188A,K243A y MsbAR78A,K299A en presencia y ausencia de lípido A (LA) 5 μM (*p = 0,047; 0,011), KDL (**p = 0,008; 0,005, *p = 0,019 ), o Ra-LPS (LRa) (**p = 0,004; 0,009). Se usó una prueba t de Student de dos caras para probar la significación estadística. e Alineación de diferentes estructuras a una región de TM5, rango de residuos de 230 a 250. Los primeros cuatro paneles que se muestran (de izquierda a derecha) corresponden a apo (este informe), unido a G907 (PDB 6BPL) y vanadato atrapado en un estructuras MsbA ocluidas (PDB 7BCW) o abiertas (este informe). El panel más a la derecha es una superposición de las cuatro estructuras. Se informan la media y la desviación estándar (n=3, réplicas biológicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En resumen, los datos de espectrometría de masas nativos revelan que MsbA co-purifica con cobre (II), una observación que pasaría desapercibida usando métodos tradicionales, y las interacciones proteína-lípido están directamente influenciadas por la unión de cobre (II), así como la conformación de la transportador Los estudios estructurales muestran que el extremo N de MsbA coordina cobre (II) de manera similar al péptido GHK. La unión de cobre (II) a MsbA afecta la unión de lípidos, y el extremo N se encuentra cerca de la bicapa donde interactúa plausiblemente con los grupos de cabeza de lípidos. En términos más generales, la unión de cobre (II) puede tener un papel regulador, como el acoplamiento de los niveles de cobre (II) con la biogénesis de LPS, y justifica una mayor investigación. Otra estructura ilumina un sitio de unión de KDL exterior distinto que es un modulador alostérico de la actividad ATPasa y una característica conservada de MsbA. Los estudios de mutagénesis documentan que este sitio alostérico exterior también es sensible a las especies de lípido A hexaacilado, como LA y LRa. Estos resultados brindan evidencia convincente de un mecanismo de activación anticipada para MsbA, un principio de control raro en las vías biosintéticas que se describe mejor para la piruvato quinasa51, ajustando la actividad de MsbA para que coincida con la producción celular de LOS citoplásmicos y sus precursores.

El gen msbA (UniProt P60752) y el plásmido pCDF-1b (Novagen) se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (New England Biolabs, NEB) de ADN genómico de Escherichia coli y plásmido purificado, respectivamente. Los cebadores se diseñaron con la herramienta de ensamblaje NEBuilder (NEB) en línea y los productos amplificados se purificaron en gel antes del ensamblaje de ADN HiFi (NEB) siguiendo el protocolo del fabricante. La construcción resultante, pCDF-MsbA, expresó MsbA con una proteína de fusión His6 escindible con TEV N-terminal. Para generar formas mutantes de MsbA, se diseñaron cebadores utilizando la herramienta en línea NEBaseChanger (NEB) y se introdujeron mutantes utilizando la mezcla de enzimas KLD (NEB) siguiendo el protocolo del fabricante. MsbA también se clonó en un plásmido pET15 modificado para expresar MsbA con una fusión C-terminal escindible con proteasa HRV3C a la supercarpeta GFP52 seguida de una etiqueta His 6x. La secuencia N-terminal de MsbA se injertó en MBP, supercarpeta GFP52 y lisozima T4 mediante subclonación en el plásmido pCDF-MsbA y conservando los residuos 1-8 de MsbA. Se ha realizado una estrategia de fusión similar para el péptido GHK53. El truncamiento del extremo N de MsbA se llevó a cabo utilizando la mezcla de enzimas KLD (NEB) siguiendo el protocolo del fabricante. La fusión GFP para la determinación exitosa de la estructura tenía una secuencia N-terminal después de la escisión de MHNDKGEELF con la proteasa TEV con la secuencia MsbA subrayada. Todos los plásmidos fueron confirmados por secuenciación de ADN. Los cebadores utilizados en este estudio se pueden encontrar en el archivo de datos de origen.

Los plásmidos de expresión de MsbA de tipo salvaje y mutante se transformaron en células competentes BL21-AI de E. coli (DE3) (Invitrogen) y se incubaron a 37 °C hasta que la DO600nm ≈ 0,6-1,0, momento en el que se indujeron los cultivos con concentraciones finales de IPTG 0,5 mM (isopropil β-D-1-tiogalactoprianoside) y arabinosa al 0,2% (p/v). Los cultivos se indujeron durante la noche a 25 °C. A continuación, los cultivos se recolectaron a 4500 × g durante 12 min y el sedimento resultante se resuspendió en Tris 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4 y se complementó con una tableta Roche cOmplete Protease Inhibitor Cocktail. La suspensión se lisó en un microfluidificador Microfluidics M-110P que funcionaba a 25.000 psi en hielo. El lisado se centrifugó a 40 000 × g durante 20 min y el sobrenadante resultante se centrifugó a 100 000 × g durante 2 h. Los sedimentos resultantes se recogieron y homogeneizaron en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 20% (v/v), pH 7,4. La solución de membrana se extrajo con DDM al 1 % (p/v), rotando durante la noche a 4 °C. A continuación, la extracción se centrifugó a 40.000 × g durante 10 min y el sobrenadante resultante se complementó con imidazol 10 mM y se filtró con un filtro de jeringa de 0,45 µm.

El material extraído se sometió a una extensa selección de detergentes37 para determinar la capacidad deslipidante de cada detergente sobre MsbA. En resumen, MsbA marcada con His se unió a 100 µl de perlas de Ni-NTA (Qiagen) equilibradas con tampón NHA (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, imidazol 10 mM, glicerol al 10 % (v/v), pH 7,4) complementado con 2 veces la concentración crítica de micelas (CMC) de DDM y luego se lavan con 5 volúmenes de columna (CV) de NHA que contienen tampón 2x CMC DDM. A continuación, la proteína unida se trató con 10 CV de NHA que contenía tampones 2x CMC DDM complementados con 10x CMC de varios detergentes (Anatrace). A continuación, la columna se volvió a equilibrar con 5 CV de tampón NHA-2x CMC DDM y se eluyó con 2 CV de NHA que contenía tampón 2x CMC DDM suplementado con imidazol 500 mM. Para comprobar el grado de eliminación de lípidos mediante espectrometría de masas nativa, el eluyente se intercambió con tampón en acetato de amonio 200 mM, 2x CMC DDM, pH 7,4 mediante columnas de centrífuga de gel Micro Bio-Spin P-6 (Biorad) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la determinación y la purificación con el lavado con detergente (NG) óptimo, la proteína se intercambió de nuevo con tampón en NHA-2x CMC DDM en una columna de desalinización HiPrep 26/10 (GE Healthcare). Luego, la muestra se trató con proteasa TEV, producida internamente, durante la noche a temperatura ambiente para eliminar la etiqueta His N-terminal, se agregó β-mercaptoetanol 10 mM durante el tratamiento con TEV. El material digerido se pasó sobre agarosa Ni-NTA equilibrada con NHA-2x CMC DDM y se recogió el flujo que contenía el material escindido. El material se concentró utilizando un concentrador centrífugo (Millipore, límite de peso molecular de 100 kDa) seguido de una inyección en una columna Superdex 200 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con HEPES 20 mM, NaCl 200 mM, 10 % (v/v ) glicerol y 2x CMC C10E5. Las fracciones máximas que contenían MsbA dimérico se agruparon y se congelaron instantáneamente a -80 °C.

Para MsbA con unión de cobre (II) reducida, se agregó MgCl2 1 mM adicional a todo el tampón y la solución de MsbA en el paso de purificación usando perlas de Ni-NTA. Se obtuvo MsbA saturado de cobre (II) mediante la adición de acetato de cobre (II) 20 uM, luego se intercambió el tampón usando una columna Bio-Spin para eliminar el exceso de cobre (II). La MsbA atrapada por el vanadato se obtuvo agregando ATP y MgCl2 a MsbA para alcanzar la concentración final de 10 mM para ambos y luego incubando a temperatura ambiente durante 10 min. Después de la incubación, se añadió vanadato (pH 10) para alcanzar una concentración final de 1 uM seguido de incubación a 37 °C durante 10 min. Las muestras de MsbA se intercambiaron con tampón usando la columna Bio-Spin a acetato de amonio 200 mM complementado con 2x CMC C10E5 para estudios nativos de MS. Para preparar muestras de MsbA para estudios Cryo-EM, MsbA y MsbA atrapada se precargaron con cobre (II) y luego se purificaron mediante una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 Increment 10/300 GL equilibrada con NaCl 200 mM, HEPES 20 mM y 2x CMC C10E5 sin glicerol. Las fracciones máximas que contenían MsbA se agruparon y concentraron a 8 mg/ml y luego se mezclaron con KDL en una proporción molar de 1:2 (1 KDL por 1 subunidad de MsbA).

Las muestras se cargaron en capilares de vidrio recubiertos de oro fabricados internamente37 y se ionizaron mediante electropulverización en un Thermo Scientific Exactive Plus Orbitrap con Extended Mass Range (EMR). Para el análisis de masas nativas, el instrumento se ajustó de la siguiente manera: compensación de CC de fuente de 25, CC de polo plano de inyección a 8,0 V, lente entre polos planos a 7, CC de polo plano doblado a 6,0, CC multipolar de transferencia a 2 y lente de entrada de trampa C a 2, presión de gas de captura a 6,0 con CID en la fuente a 60,0 eV y CE a 100, voltaje de pulverización a 1,70 kV, temperatura capilar a 200 °C, tiempo máximo de inyección a 200 ms. Los espectros de masas se adquirieron con un ajuste de resolución de 17.500, microscans de 1 y un promedio de 100.

Los lípidos se prepararon como se describió anteriormente54, en los que los lípidos disueltos en cloroformo se secaron bajo un flujo de nitrógeno colocado al vacío durante la noche y luego se disolvieron en agua. La concentración de MsbA se determinó usando un ensayo de proteína DC (BioRad) con albúmina de suero bovino como estándar. MsbA se incubó con lípidos en concentraciones variables y se mezcló con acetato de amonio 200 mM complementado con óxido de laurildimetilamina 2x CMC (LDAO) en una proporción de volumen de 1:1. Las muestras se incubaron en la cámara de fuente de ionización por electropulverización nano durante un minuto para alcanzar el equilibrio antes de la adquisición de datos. Estas muestras se analizaron en el espectrómetro de masas Orbitrap Exactive Plus EMR (Thermo Scientific) que funciona con configuraciones idénticas a las descritas anteriormente. Los espectros de masas para cada evento de titulación se obtuvieron por triplicado. Los espectros de masas se desconvolucionaron usando UniDec55 y se determinaron las intensidades máximas resultantes para apo y proteína unida a lípidos. La abundancia relativa de cada especie se determinó dividiendo la intensidad máxima por la intensidad total para convertirla en fracción molar para cada experimento independiente. Para la unión de MsbA (P) al lípido Nth (Ln), aplicamos el siguiente modelo de unión secuencial de lípidos:

dónde:

Para calcular la fracción molar de una especie particular54:

Para cada titulador en la titulación, la concentración libre de lípidos se calculó de la siguiente manera:

El modelo de unión secuencial de lípidos se ajustó globalmente a los datos de fracción molar mediante la minimización de la función pseudo-\({\chi }^{2}\):

donde n es el número de ligandos unidos y d es el número de puntos de datos de fracción molar experimental.

Se enviaron muestras de MsbA al Laboratorio de Análisis Elemental de la Universidad Texas A&M para su análisis elemental mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Se utilizó un espectrómetro de masas NexION ICP (PerkinElmer) con los parámetros operativos proporcionados en la Tabla complementaria 2.

Se resuspendió POPC (Avanti) en cloroformo y se secó bajo una corriente de gas nitrógeno. La película se lavó con pentano y se secó de nuevo bajo una corriente de gas nitrógeno. La película lipídica se almacenó en un desecador durante la noche y se rehidrató hasta una concentración final de 20 mM en tampón de rehidratación (HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM), se agitó ocasionalmente durante una hora y luego se almacenó a -80 °C. La mezcla de liposomas (~150 μL) se diluyó a la mitad con el tampón de rehidratación y se extruyó utilizando una miniextrusora (Avanti Polar Lipids) con una membrana de policarbonato de 100 nm hasta que la solución se volvió translúcida. A continuación, los liposomas extruidos se separaron en dos porciones diferentes de igual volumen: una para la proteína de tipo salvaje y otra para la mutante. A continuación, los liposomas extruidos se solubilizaron con un volumen igual de tampón de solubilización (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 150 mM y DDM 20 mM) y se rotaron a temperatura ambiente durante 30 min o hasta que quedaron transparentes. A continuación, las muestras de MsbA se añadieron en una proporción de proteína a lípido de 1:100 (p/p) y se rotaron durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron BioBeads a los liposomas y se rotaron durante la noche a 4 °C para eliminar el detergente.

La actividad ATPasa de MsbA se determinó siguiendo una versión modificada del ensayo con verde de malaquita56. Para la proteína completamente deslipidada (apo), se incubaron 400 nM de MsbA (en acetato de amonio 200 mM suplementado con 1x CMC C10E5 y 1x CMC LDAO) con 5 mM MgCl2 y 200 μM ATP a 37 °C durante 12 min. Para el análisis de proteína con KDL, se añadió lípido a la muestra a una concentración final de 5 µM. Las muestras de punto final se recogieron a los 3, 6, 9, 12 min y se detuvieron con la adición de una solución de verde de malaquita con los siguientes componentes: mezcla 3:1 de 0,045 % (p/v) de verde de malaquita y 4,2 % (p/v) de amonio molibdato preparado en HCl 4 N, Triton X-100 al 0,04% (v/v) (concentración final). Luego se añadió citrato de sodio al 34% (p/v) para detener la reacción de coloración. Las reacciones apagadas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min y se midió la absorbancia a 650 nm en un lector de placas CLARIOstar (BMG LabTech). La tasa de hidrólisis de ATP se obtuvo trazando la pendiente de absorbancia de las muestras recolectadas a los 3, 6, 9 y 12 min.

Se llevaron a cabo ensayos iniciales de cristalización para la proteína de fusión GFP a una concentración de 1 mM (utilizando un coeficiente de extinción a 490 nm de 39,2 × 103 M−1 cm−1)52 utilizando un robot de cristalización Mosquito LCP (TTP Labtech) en gota colgante placas a 20 °C. Los cristales crecieron en la condición índice C5 (60 % Tacsimate pH 7,0) y se optimizaron aún más aumentando la concentración de Tacsimate pH 7,0 al 70 %. Los cristales se crioprotegieron utilizando Tacsimate al 100 %, pH 7,0. Los monocristales se montaron con CrystalCap HT Cryoloops (Hampton Research) antes de la congelación instantánea en nitrógeno líquido. Los datos de difracción iniciales se recopilaron internamente en un Rigaku Raxis-IV++. Las fases iniciales se determinaron usando reemplazo molecular con código PDB 2B3P. El refinamiento y la construcción del modelo se realizaron con Phenix57 y Coot58. Los datos anómalos se recopilaron utilizando una longitud de onda de 1,378 Å en la fuente de fotones avanzada en la línea de luz 24-ID-C. Aunque la estructura podría determinarse mediante la fase SAD utilizando el programa Phenix AutoSol, el modelo construido a partir de los datos internos se utilizó para el reemplazo molecular seguido de la construcción y el refinamiento del modelo.

La vitrificación se realizó utilizando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) operando a 8 °C y 100 % de humedad. Se aplicó un total de 3,5 μL de muestra (8 mg/mL de MsbA cargado con cobre, ya sea apo o atrapado con ADP-vanadato en NaCl 200 mM, HEPES 20 mM pH 7,4, suplementado con 2x CMC C10E5) a rejillas de carbón perforadas (Quantifoil 300 mesh Cu 1.2/1.3) descarga luminiscente durante 30 s. Las muestras contenían un exceso molar doble de KDL. Las rejillas se secaron durante 5 s con una fuerza de transferencia 1 utilizando papel de filtro Vitrobot estándar (Ted Pella, 47000-100) y luego se sumergieron en etano líquido.

Las cuadrículas optimizadas se enviaron a la Instalación de Microscopía Electrónica Avanzada de la Universidad de Chicago para la recopilación de datos. El conjunto de datos se recopiló como pilas de películas con un microscopio electrónico Titan Krios que funciona a 300 kV, equipado con una cámara detectora directa K3. Las imágenes se registraron con un aumento nominal de 81 000x en el modo de conteo de superresolución por cambio de imagen. El tiempo de exposición total se estableció en 4 s con un cuadro registrado cada 0,1 s, lo que resultó en 40 cuadros en una sola pila con una exposición total de alrededor de 50 electrones/Å2. El rango de desenfoque se fijó en −1,0 a −2,5 μm. Consulte la Tabla complementaria 8 para conocer los detalles de los parámetros de recopilación de datos.

Las películas recopiladas se sometieron a la corrección de movimiento de MotionCor259. El procesamiento posterior se llevó a cabo en cryoSPARC60. El flujo de procesamiento de datos detallado se muestra en la Fig. 15 complementaria (MsbA atrapada con vanadato) y la Fig. 22 complementaria (MsbA abierto, orientado hacia adentro). La deriva del escenario y el movimiento anisotrópico de las imágenes de la pila se corrigieron primero mediante la corrección de movimiento basada en parches. Los parámetros de CTF para cada micrografía se determinaron mediante estimación de CTF basada en parches. Para MsbA atrapada con vanadato, las partículas se seleccionaron utilizando las plantillas generadas a partir del selector de manchas. Para el MsbA abierto y orientado hacia adentro, el conjunto final de partículas se seleccionó utilizando plantillas generadas a partir de un modelo 3D de una reconstrucción anterior. Para ambos conjuntos de datos, las partículas se limpiaron mediante dos rondas de clasificación 2D. Se generaron tres modelos iniciales a partir de las partículas restantes utilizando una reconstrucción ab initio. Las partículas se clasificaron además por refinamiento heterogéneo basado en tres modelos iniciales. Para el MsbA atrapado con vanadato, se seleccionó la mejor clase de partículas para un refinamiento no uniforme con desenfoque por partícula y optimización CTF, y se impuso una simetría C2, lo que resultó en un mapa final resuelto en 3,6 Å. Para el MsbA abierto, se seleccionó la mejor clase de partículas para un refinamiento no uniforme con simetría C2 o C1 impuesta, lo que resultó en mapas finales resueltos en 3,88 Å y 4,06 Å, respectivamente. Consulte la Tabla complementaria 8 para conocer los detalles de las estadísticas de procesamiento de imágenes.

La estructura previamente informada17 de MsbA con ADP-vanadato de Escherichia coli (PDB 5TTP) se acopló al mapa crio-EM usando Chimera61. El modelo se refinó manualmente usando Coot58. Phenix57 se utilizó para generar las coordenadas y los archivos de restricción para KDL. El modelo final se sometió a múltiples rondas de refinamiento en el espacio real utilizando Phenix con restricciones de estructura secundaria y Ramachandran. Los valores atípicos de la geometría se corrigieron manualmente en Coot (después de cada ronda). Las estadísticas de la ronda final de refinamiento del modelo y la geometría del modelo se informan en la Tabla complementaria 9. Las figuras se generaron utilizando ChimeraX62 y Pymol (Schrödinger LLC., versión 2.1). Consulte la Tabla complementaria 9 para conocer los detalles de las estadísticas del modelo.

Las secuencias para el análisis de conservación se recopilaron usando NCBI Blast y la proteína MSBA de E. coli como entrada. Buscamos por separado secuencias de MSBA de gammaproteobacteria, deltaproteobacteria, alfaproteobacteria, epsilonproteobacteria, el clado FCB y Bacilli para obtener una amplia representación en Bacteria. Luego alineamos las secuencias con Muscle 3.83. Eliminamos todas las brechas causadas por la ausencia de la secuencia en la secuencia de E. coli y extrajimos los sitios que interactúan con KDL mediante un script de python personalizado. Se utilizó una subalineación que contenía solo estos sitios con el servidor weblogo (https://weblogo.berkeley.edu/) para generar el logotipo de secuencia. Para el análisis de las secuencias N-terminales de los transportadores ABC, se descargaron más de 20 k secuencias de MsbA de UniProt. Una secuencia de comandos de Python que usa BioPython63 analizó secuencias que contenían una secuencia N-terminal de comenzar con MH.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura para la estructura cristalina de un fragmento N-terminal de MsbA fusionado con GFP y unido a cobre (II) se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) con el código de acceso 8DHY (Cobre (II)-bound MsbA péptido N-terminal fusionado con GFP). Las estructuras y mapas cryoEM de MsbA se han depositado en PDB y EMDB de la siguiente manera: 8DMO (MsbA abierto, orientado hacia adentro) y EMD-27545 (MsbA abierto, orientado hacia adentro); y 8DMM (MsbA atrapada con vanadato y unida a KDL) y EMD-27544 (MsbA atrapada con vanadato y unida a KDL). Las estructuras proteicas informadas anteriormente utilizadas en este estudio son: 5TTP (MsbA ocluida, orientada hacia el exterior); 6BPP (MsbA en complejo con G092); 6BPL (MsbA en complejo con G907 y LPS); 7BCW (MsbA atrapada en vanadato); 6BL6 (Salmonella typhimurium MsbA abierta, orientada hacia dentro); 3B60 (salmonella typhimurium MsbA abierta, orientada hacia el exterior); y 2B3P (supercarpeta GFP). Los datos nativos de MS se han depositado en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7268757). Con este documento se proporciona un archivo de datos de origen. Otros datos asociados con este manuscrito están disponibles a pedido.

El código de Python para determinar las constantes de enlace de equilibrio individuales está disponible en https://github.com/LaganowskyLab.

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Agradecemos a Bryan Tomlin en el Laboratorio de Análisis Elemental por el análisis elemental, a Jonathan Schuermann e Igor Kourinov en APS por la útil discusión sobre la recopilación de datos. También agradecemos a Lauren Stover por la ayuda en la preparación del liposoma MsbA. Parte de este trabajo se basa en la investigación realizada en las líneas de luz del Equipo de Acceso Colaborativo del Noreste (P30 GM124165) en la Fuente de Fotones Avanzada (DE-AC02-06CH11357). Este trabajo también fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo los números de subvención (DP2GM123486, R01GM121751, R01GM139876, R01GM138863 y RM1GM145416 para AL; R35GM143052 para MZ; y P41GM128577 para DR) y la Sociedad Max Planck para GKAH. Agradecemos al personal de Microscopía Electrónica Avanzada de la Universidad de Chicago (RRID:SCR_019198) por la ayuda con la recopilación de datos crio-EM. Agradecemos a Research Computing Center de la Universidad de Chicago por el apoyo de este trabajo al proporcionar los recursos informáticos del clúster Beagle3 HPC financiado por NIH (S10OD028655).

Carlos Packianathán

Dirección actual: Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed, Instalación Piloto de Bioproducción, Silver Spring, 20910, MD, EE. UU.

Departamento de Química, Universidad Texas A&M, College Station, 77843, TX, EE. UU.

Jixing Lyu, Tianqi Zhang, Samantha Schrecke, Nicklaus P. Elam, Charles Packianathan, David Russell y Arthur Laganowsky

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Chicago, Chicago, 60637, IL, EE. UU.

Chang Liu y Minglei Zhao

Instituto Max Planck de Microbiología Terrestre y Departamento de Química, Universidad de Marburg, Marburg, Alemania

Georg K.A. Hochberg

Centro de Microbiología Sintética (SYNMIKRO), Departamento de Química, Universidad de Marburg, Marburg, Alemania

Georg K.A. Hochberg

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JL y AL diseñó la investigación. JL, TZ, NE y CP expresaron y purificaron MsbA. JL realizó experimentos de espectrometría de masas. JL y TZ llevaron a cabo los ensayos funcionales. JL, MZ, DR y AL analizaron los datos. CL y MZ recopilaron y procesaron datos crio-EM. SS, JL, TZ y AL realizaron cristalografía de rayos X. SS, CL, JL, MZ y AL construyeron los modelos atómicos. GH y AL analizaron las secuencias de MsbA. JL y AL escribieron el manuscrito con aportes de los otros autores.

Correspondencia a Arthur Laganowsky.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Antonio Calabrese, Erik Yukl y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Lyu, J., Liu, C., Zhang, T. et al. Base estructural para la regulación de lípidos y cobre del transportador ABC MsbA. Nat Comun 13, 7291 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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Recibido: 01 Agosto 2022

Aceptado: 10 de noviembre de 2022

Publicado: 26 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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